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长梗黄精11个微卫星位点的筛选及跨种扩增

长梗黄精11个微卫星位点的筛选及跨种扩增

作者：刘婷婷安徽师范大学

学位级别：硕士

微卫星分子标记属于共显性的遗传标记,具有高度的多态性,而且是中性遗传的,所以在目前被认为是最好的用于群体基因研究的孟德尔分子标记。本文采用磁珠富集法构建了长梗黄精(Polygonatum filipes Merr.)的(CT)二碱基重复的微卫星文库,... 详细信息

微卫星分子标记属于共显性的遗传标记,具有高度的多态性,而且是中性遗传的,所以在目前被认为是最好的用于群体基因研究的孟德尔分子标记。本文采用磁珠富集法构建了长梗黄精(Polygonatum filipes Merr.)的(CT)二碱基重复的微卫星文库,从中筛选到25个微卫星位点标记,并利用这些微卫星位点对来自安徽黄山的一个自然种群的21个个体进行多态性分析。分析结果显示有11个位点具有较高的多态性,每个位点的等位基因数目3-7个不等。观察杂合度在0.238到0.762之间,平均值为0.593。期望杂合度从0.472到0.790,平均值为0.711。其中,位点Pt6和Pt7偏离了Hardy-Weinberg平衡,MICRO-CHECKER分析显示偏离原因是无效等位基因的存在。每个位点之间没有显著的连锁关系。由于微卫星分子标记在近缘种中具有较高的通用性,因此,从长梗黄精中筛选出的11个多态性位点又在同科同属的黄精(P. sibiricum)﹑湖北黄精(P. zanlanscianense)﹑安徽黄精(P. anhuiense)﹑多花黄精(P. cyrtonema)﹑玉竹(P. odoratum)这5个物种中进行跨种扩增。结果显示,Pt1﹑Pt4﹑Pt5﹑Pt6﹑Pt9和Pt11这6个位点能够成功的在5个物种中进行扩增。除了湖北黄精,Pt3和Pt10能够在另外的4个种中获得扩增产物。这些多态性位点将是黄精属植物的种质保存、遗传多样性、种群遗传学、繁育系统等研究的有用工具。

关键词：长梗黄精微卫星标记跨种扩增种群遗传学

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3种石斑鱼微卫星标记的开发及跨种扩增

3种石斑鱼微卫星标记的开发及跨种扩增

作者：赵丽丽南昌大学

学位级别：硕士

微卫星标记由于多态性高、共显性等特点被广泛应用于生物群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建等方面。石斑鱼是重要的世界性海水养殖鱼类,然而其遗传多样性的研究还十分有限。目前在石斑鱼中缺乏足够的微卫星标记。因此,为了评估石斑鱼... 详细信息

微卫星标记由于多态性高、共显性等特点被广泛应用于生物群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建等方面。石斑鱼是重要的世界性海水养殖鱼类,然而其遗传多样性的研究还十分有限。目前在石斑鱼中缺乏足够的微卫星标记。因此,为了评估石斑鱼的遗传多样性,进行分子辅助育种以指导生产,迫切需要开发大量的微卫星标记。通过FIASCO法构建七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)、青石斑鱼(Epinephelus awoara)、美洲黑石斑鱼(Centropristisstriata)的基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,酶切片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中。菌落PCR法筛选阳性克隆,挑选不同大小的阳性克隆测序(ABI 3730)。从七带石斑鱼、青石斑鱼、美洲黑石斑鱼的基因组微卫星富集文库中,分别得到66,56,39个微卫星序列。应用primer3软件对所筛选的微卫星序列进行引物设计,分别得到55,36,28对引物。通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行筛选,3种石斑鱼中分别得到12,12,11个多态性微卫星标记,并对各个位点等位基因数目、等位基因片段大小范围、观察杂合度、期望杂合度指标进行初步分析。结果表明:FIASCO法能有效提高微卫星标记筛选效率。将研究所得到的多态性微卫星标记在这3种石斑鱼中互相跨种扩增。大部分座位能得到较好的扩增结果。因此,可将本研究开发的微卫星标记尝试性地用于其他石斑鱼的遗传多样性等研究,为石斑鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状基因的定位等研究提供候选微卫星标记。

关键词：七带石斑鱼青石斑鱼美洲黑石斑鱼微卫星标记 FIASCO法跨种扩增

两种经济动物微卫星标记的跨种扩增及遗传多样性分析

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两种经济动物微卫星标记的跨种扩增及遗传多样性分析

作者：闵金金浙江师范大学

学位级别：硕士

世界上最大的淡水龟—大鳄龟(Macroclemys temminckii)是我国的引进种,野生资源分布于北美洲,是集食用、观赏、药用于一身的水产肉类经济动物。近二十年中,由于过度的捕杀,野生大鳄龟的数目逐渐下降,已被列为世界濒危野生动物保护红皮... 详细信息

世界上最大的淡水龟—大鳄龟(Macroclemys temminckii)是我国的引进种,野生资源分布于北美洲,是集食用、观赏、药用于一身的水产肉类经济动物。近二十年中,由于过度的捕杀,野生大鳄龟的数目逐渐下降,已被列为世界濒危野生动物保护红皮书名录,其保护生物学的研究受到广泛的关注。背瘤丽蚌(Lamprotula leai)是丽蚌属中产量大、分布广的常见种之一,其贝壳厚实,肉可以食用或做饲料,也是大型有核珍珠珠核的主要原材料,具有较高的经济价值。我国安徽、江苏、浙江、江西等省的大、中型湖泊及河流中均有分布,是我国特有的淡水经济贝类。人为的过度捕捉、环境污染等因素使得野生资源数目越来越少,分布的区域也在急剧缩小。目前背瘤丽蚌已被确定为安徽省一级保护水生野生动物和湖北省二级保护动物。大鳄龟和背瘤丽蚌都是我国水产养殖的热门品种,带动了地区经济的发展。目前为止,两个物种的种质资源信息尚不完善,国内对于二者的遗传多样性和遗传结构研究尚未涉及。理论的研究不足与当今的养殖迅猛趋势极不相称,这极大阻碍了两种经济动物养殖的可持续发展。为了建立种质资源及为分子育种提供遗传资料,更好地保护野生资源,本研究运用跨种扩增法筛选了大鳄龟和背瘤丽蚌的微卫星标记,同时运用本研究获得的微卫星引物分析了两种经济动物的遗传多样性以及遗传结构。主要研究结果如下：1.通过跨种扩增法成功筛选8个具有多态性的大鳄龟微卫星位点并且对于24个个体进行了遗传多样性分析。共发现有30个等位基因,平均为3.75个;观测杂合度(Ho)的范围是0.042-0.955,平均为0.385;期望杂合度(HE)的范围为0.042-0.812,平均为0.479;多态信息含量范围为0.040-0.759,平均为0.423。经过卡方检验,有4个位点显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(PX49、BHT32、BHT64、Cc-8),通过Micro-checker对位点进行检测,发现PX49、BHT64微卫星标记存在无效等位基因,这可能是造成偏离Hardy-Weinberg平衡的主要原因。高密度养殖、样本的数目较少也可能是造成偏离Hardy-Weinberg平衡的原因。总体上筛选出的8个微卫星位点可以进一步用于大鳄龟的遗传多样性和群体遗传结构的研究。2.通过跨种扩增筛选得到15对具有多态性背瘤丽蚌微卫星位点,并对4个背瘤丽蚌地理种群：鄱阳湖(PY)、洞庭湖(DT)、洪泽湖(HZ)、安庆湖(AQ)进行了遗传结构分析。结果显示：4个种群总共检测到114个等位基因,其中数目从2到21个不等,平均等位基因数为7.6;鄱阳湖拥有最高的观测杂合度(Ho)0.455,洪泽湖具有最大的期望杂合度(HE)0.868。背瘤丽蚌4个群体在各个位点的多态信息含量和遗传杂合度都较高,遗传多样性较丰富,具有较好的群体遗传结构。检测发现所有位点不存在连锁不平衡现象,表明这些微卫星位点可以用来分析物种的遗传信息。分子变异方差分析表明,12.56%的分化存在于种群间,44.68%的分化存在于种群内部。两两种群间的Fst值在0.073和0.145之间,全部小于0.15,说明种群间存在中等程度分化。UPGMA聚类分析表明安庆湖(AQ)和洞庭湖(DT)聚为一支,推断安庆湖个体可能来自洞庭湖;鄱阳湖(PY)和洪泽湖(HZ)聚为一支,这种现象可能与湖泊分布的地理位置有关,最后两支相聚。本研究为背瘤丽蚌的亲本选育以及种质开发提供了遗传数据。

关键词：大鳄龟背瘤丽蚌微卫星跨种扩增遗传多样性遗传结构

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义乌小鲵微卫星位点的跨种扩增

安徽农业科学 2018年第20期46卷 83-85页

作者：刘盼陈雅琴邵晨王宇浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

[目的]筛选具有多态性的义乌小鲵(Hynobius yiwuensis)微卫星位点。[方法]采用跨种扩增的方法从安吉小鲵(***)和中国小鲵(***)的113个微卫星位点中筛选具有多态性的义乌小鲵微卫星位点。[结果]筛选出11个具有多态性的义乌小鲵微卫星位... 详细信息

[目的]筛选具有多态性的义乌小鲵(Hynobius yiwuensis)微卫星位点。[方法]采用跨种扩增的方法从安吉小鲵(***)和中国小鲵(***)的113个微卫星位点中筛选具有多态性的义乌小鲵微卫星位点。[结果]筛选出11个具有多态性的义乌小鲵微卫星位点。这些多态性微卫星位点的等位基因数为2~6个(平均3.55),观察杂合度为0.200~1.000(平均0.510),期望杂合度为0.500~0.732(平均0.662),多态信息含量为0.375~0.737(平均0.588)。[结论]筛选得到的具有多态性的11个义乌小鲵微卫星位点可应用于其种群遗传学和保护遗传学的研究。

关键词：义乌小鲵微卫星跨种扩增多态性

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大叶黑桫椤及桫椤SSR标记的开发（英文）

中山大学学报（自然科学版） 2017年第1期56卷 115-120页

作者：阮效先王桢王艇苏应娟中山大学生命科学学院广东广州510275 南京农业大学生命科学学院江苏南京210095 华南农业大学生命科学学院广东广州510642 深圳市中山大学研究所广东深圳518057

大叶黑桫椤是桫椤科的大型树蕨,多分布在亚热带山地,为渐危种。迄今为止,鲜有大叶黑桫椤种群遗传变异的报道。采用FIASCO法开发了大叶黑桫椤15个SSR标记,用来自海南岛的4个种群检测标记的多态性。其中,7个标记具多态性,每个标记的实际... 详细信息

大叶黑桫椤是桫椤科的大型树蕨,多分布在亚热带山地,为渐危种。迄今为止,鲜有大叶黑桫椤种群遗传变异的报道。采用FIASCO法开发了大叶黑桫椤15个SSR标记,用来自海南岛的4个种群检测标记的多态性。其中,7个标记具多态性,每个标记的实际等位基因数为1~9,观察杂合度和期望杂合度范围分别为0~0.769和0~0.805。位点AG-12和AG-23分别在HNjfl和HNbwl种群显著地偏离哈代温伯格平衡。鉴定出4个哑等位基因。发现3对标记存在连锁不平衡现象。此外,4个SSR标记能成功地用于桫椤种群的遗传分析。这些新的多态性SSR标记将用于大叶黑桫椤的群体遗传变异、局部适应性的研究以及建立有效的保护策略。

关键词：大叶黑桫椤 SSR标记跨种扩增遗传变异局部适应性

猕猴桃EPIC标记开发及其在猕猴桃属植物系统发育分析中的应用

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园艺学报 2013年第6期40卷 1162-1168页

作者：刘磊姚小洪黄宏文中国科学院武汉植物园中国科学院种质创新与特色农业重点实验室武汉430074 中国科学院大学北京100049 中国科学院华南植物园中国科学院植物资源保护及可持续利用重点实验室广州510650

采用生物信息学方法通过比较ESTs数据和基因组数据开发了猕猴桃的双亲遗传单拷贝的EPIC标记以用于猕猴桃属植物系统发育研究。通过比较中华猕猴桃（Actinidiachinensis）和美味猕猴桃（***）的ESTs数据和葡萄（Iqtisvinifera）基因组数... 详细信息

采用生物信息学方法通过比较ESTs数据和基因组数据开发了猕猴桃的双亲遗传单拷贝的EPIC标记以用于猕猴桃属植物系统发育研究。通过比较中华猕猴桃（Actinidiachinensis）和美味猕猴桃（***）的ESTs数据和葡萄（Iqtisvinifera）基因组数据，以一致性85％为标准共检测到129个EPIC标记，并从中设计96对引物。其中21对EPIC引物在中华猕猴桃和美味猕猴桃两个商业化栽培品种中呈现稳定扩增，核酸多态性（Pj）为0．003～0．069，变异位点为0．7％-14．8％，简约性信息位点为0～9．4％。用其中的EPIC．1标记重建中华猕猴桃、美味猕猴桃、毛花猕猴桃（Aeriantha）、绵毛猕猴桃（Afulvicom口var．1anata）和金花猕猴桃（***）的系统发育关系，显示其跨种间扩增的实用性并获得分辨率较高的系统发育树。本研究中开发的EPIC标记可以作为通用引物用于猕猴桃属植物系统发育分析。

关键词：猕猴桃属 EPIC标记跨种扩增系统发育

微卫星标记在人工养殖小体鲟种群的数据分析方法比较和遗传多样性分析

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大连海洋大学学报 2016年第5期31卷 516-521页

作者：董颖杨瑞姜志强胡红霞大连海洋大学水产与生命学院辽宁大连116023 北京市水产科学研究所北京100068 渔业生物技术北京市重点实验室北京100068

为获得可用于小体鲟Acipenser ruthenus种群遗传多样性分析的微卫星分子标记,采用跨种PCR扩增的方法从已发表的近缘种微卫星DNA标记引物中筛选得到13个具有多态性的位点,同时为了探讨更适合多倍体样品的微卫星数据读取方法,分别采用比... 详细信息

为获得可用于小体鲟Acipenser ruthenus种群遗传多样性分析的微卫星分子标记,采用跨种PCR扩增的方法从已发表的近缘种微卫星DNA标记引物中筛选得到13个具有多态性的位点,同时为了探讨更适合多倍体样品的微卫星数据读取方法,分别采用比例法和补齐法对微卫星数据进行分析。结果表明：两种数据读取方法的分析结果无显著性差异（P〉0.05）;本研究中选用补齐法对小体鲟种群遗传多样性进行分析,结果显示,小体鲟种群等位基因数（Na）从5个到30个不等,表观杂合度（H_O）范围为0.089 6-0.940 3,平均为0.648 0,期望杂合度（H_e）范围为0.085 2~0.912 6,平均为0.719 3,种群Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数（d）平均为-0.098 0,种群多态信息含量（PIC）平均为0.702 8;筛选得到的13个微卫星位点是适用于小体鲟种群遗传研究的具有多态性的良好分子标记。研究表明,被检测的小体鲟养殖种群存在一定程度的近交现象,建议通过引进不同来源亲本加以改善,以增加种群遗传多样性的丰富度。

关键词：小体鲟微卫星跨种扩增遗传多样性

石蒜高多态性微卫星位点的筛选、鉴定及跨种分析

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石蒜高多态性微卫星位点的筛选、鉴定及跨种分析

作者：宣守芹安徽师范大学

学位级别：硕士

石蒜(Lycoris radiate)属于石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris),为多年生鳞茎类草本植物,喜阴湿,主要分布于中国长江中下游和部分东南亚国家。石蒜用于中药已有很长的历史,其鳞茎主要含有石蒜碱和加兰他敏两种医药成分,加兰他敏为... 详细信息

石蒜(Lycoris radiate)属于石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris),为多年生鳞茎类草本植物,喜阴湿,主要分布于中国长江中下游和部分东南亚国家。石蒜用于中药已有很长的历史,其鳞茎主要含有石蒜碱和加兰他敏两种医药成分,加兰他敏为可逆性胆碱酯酶抑制剂,可用于青光眼和阿尔茨海默症等病的治疗。另外石蒜是秋赏其花、冬赏其叶的园艺植物,因此它是一类兼具观赏价值与药用价值的经济植物。本实验利用磁珠富集法(modified biotin-capture method)原理,筛选了石蒜特异的33个微卫星(microsatellite)位点,并对安徽黄山的21个石蒜个体的多态性位点作了进一步分析,最终筛选出10对多态性高的SSR引物。通过Genepop、Micro-Checker等软件,我们检测了10对引物的等位基因(NA)数目和大小、观测杂合度(H)和期望杂合度(H)等。每个位点等位基因的数目从2-9个不等,观测杂合度和期望杂合度的值分别位于0.238-0.952和0.455-0.784之间。我们发现这10个多态性位点中,除Lyra-7外,其余9个位点均不偏离Hardy–Weinberg平衡(p>0.05)。同时通过软件Micro-Checker分析,得知Lyra-7存在无效等位基因(p种中的通用性,我们进行了跨种扩增,包括琅琊山的安徽石蒜(L. anhuiensis)、琅琊山的长筒石蒜(L. longituba)、金寨的中国石蒜(L. chinensis)、马鞍山的换锦花(L. sprengeri)以及日本宫崎的乳白石蒜(L. albiflora)。每个物种选取3-5个个体。经统计发现,Lyra-5和Lyra-6两个位点在5个物种中均能扩增出条带,Lyra-1和Lyra-2位点除了换锦花外在其余4个物种中均能扩增,除了Lyra-10,其余9个位点均能在乳白石蒜中扩增。结果显示这些微卫星位点将可用于石蒜和石蒜属其它物种的遗传学研究。

关键词：石蒜微卫星标记多态性跨种扩增

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多花黄精微卫星标记的开发和利用

多花黄精微卫星标记的开发和利用

作者：程文娟安徽师范大学

学位级别：硕士

多花黄精(Polygonatum cyrtonema)属于黄精属,为多年生草本植物,主要分布于长江流域。其干燥根茎可作为黄精药材入药。最近研究还发现从多花黄精中提取的挥发油可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粘红酵母、人工培养条件下非小细胞肺... 详细信息

多花黄精(Polygonatum cyrtonema)属于黄精属,为多年生草本植物,主要分布于长江流域。其干燥根茎可作为黄精药材入药。最近研究还发现从多花黄精中提取的挥发油可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粘红酵母、人工培养条件下非小细胞肺癌癌细胞的生长。此外多花黄精外形优美,具有较高的观赏价值。然而由于人类不合理的开发利用,多花黄精野生资源急剧减少。研究多花黄精野生种群内及种群间的遗传变异将有助于我们理解多花黄精的演化进程和制定合理的保护策略。简单重复序列或微卫星DNA是指基因组中由1-6 bp碱基重复单位组成的串联重复。由于微卫星分子标记具有高多态性、共显性遗传、结果稳定可靠、在基因组中分布广泛等特点,因此成为目前最为常用的分子标记,广泛的用于遗传图谱的构建、研究物种进化与亲缘关系、种群遗传学和保护生物学等研究领域。我们利用磁珠富集法构建了多花黄精微卫星富集文库,挑取了110个阳性克隆测序,并根据测序结果设计合成了55对引物。通过PCR筛选,得到22对能稳定扩增出特异性产物的引物。对1个居群的23个个体,8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,12对引物的PCR产物呈现长度多态性。通过此方法我们首次开发出12个多态性微卫星分子标记。每个位点含2-11个等位基因,期望杂合度和观察到的杂合度分别为0.268-0.865和0.273-0.727。这12个引物在其它四种黄精属植物中跨种扩增的结果显示9对引物有较好的通用性。这些多态性微卫星分子标记将为多花黄精以及多花黄精近缘物种的种群遗传学、种质保存和保护等研究提供有利工具。

关键词：多花黄精微卫星分子标记磁珠富集跨种扩增