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那不勒斯热袍菌纤维素酶的表达、酶学性质分析及应用

那不勒斯热袍菌纤维素酶的表达、酶学性质分析及应用

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作者： Reham Mohammed Mohammed Ebaid 江苏大学

学位级别：硕士

在生物质的各种工业应用中,生物燃料的生产越来越受到重视。许多因素影响生物质能转化为生物燃料,如生物质成分、水分含量和最终所需的能源产品。在各种转化方法中,酶解法将生物质转化为可发酵糖具有高产、低能耗、高选择性和生态友好... 详细信息

在生物质的各种工业应用中,生物燃料的生产越来越受到重视。许多因素影响生物质能转化为生物燃料,如生物质成分、水分含量和最终所需的能源产品。在各种转化方法中,酶解法将生物质转化为可发酵糖具有高产、低能耗、高选择性和生态友好等优点。在这方面,超嗜热酶在极端温度下的稳定性使它们具有独特的生物质转化潜力。近年来,为了提高耐热酶的生物产量和稳定性,人们进行了大量的试验。除了优化生长条件和使用化学方法外,还开发了许多新的遗传表达系统。本研究利用pHsh-T载体,从那不勒斯热热袍菌中分离到嗜热纤维素酶(hyperthermophilic cellulase,HTC)基因并在大肠杆菌中表达。确定了该酶95℃为最佳温度。最佳pH值在6.0-6.5之间,在碱性环境中比在酸性环境中更稳定。此外,该酶在95℃孵育时表现出较高的热稳定性,孵育5小时后活性最高。HTC的这些优越性质有力地支持了酶在纤维素生物质水解中用于生物燃料生产或其他工业中的应用。木质纤维素生物质中木质素的存在以及纤维素和半纤维素的解聚限制了酶法转化生物质的效率。微藻和蓝藻由于其细胞壁缺乏木质素,因此被认为是生物燃料(第三代)的潜在原料。在不同种类的蓝藻中,螺旋藻(Spirulina platensis)被认为是最具应用潜力的原料,包括生物燃料的生产。因此,本论文研究了静态磁场(SMF)对螺旋藻生物量生产、碳水化合物积累的影响及其对镉离子(Cd)去除率的影响。此外,还研究了HTC对SMF和高浓度Cd条件下生长的螺旋藻水解的影响。施用6 h·天的SMF,螺旋藻生物量的生产强度最高为0.198 g·L·天。然而,Cd浓度为10 mg·L和15mg·L时,螺旋藻生物量分别比对照降低了8.8%和12.5%。与对照相比,SMF组合显著提高了30.1%的生物量。另一方面,初始Cd浓度的增加导致Cd去除率显著降低,分别为10 mg·L和15 mg·L时的79.7%和61.5%。有趣的是,在初始Cd浓度为10mg·L和15 mg·L的培养基中,使用SMF 6 h·天可以提高Cd的去除率,在20天后,这两种培养基的去除率分别提高了91.4%和82.3%,分别比未经SMF处理的培养基提高了6.3%和25.3%。此外,SMF的应用导致碳水化合物的积累,并同时促进生长,这导致碳水化合物的产量在未经处理的培养基上显著增加。纤维分析结果为7.3%的dw纤维素和13.2%的dw半纤维素,未检测出木质素。以螺旋藻为原料,采用酶法水解螺旋藻,并与传统的酸预处理方法进行了比较。在最高应用浓度(10%)的应用条件下,酸预处理显示,最大还原糖量为1.37μg·mL。然而,使用10μL HTC酶,孵化基质30分钟,应用结果显示达到它的最大还原糖量为1.39μg·mL。另外利用红外光谱来确定纤维水解的程度,分析了结构性变化。在生物质原料中,3422 cm的条带对应O-H拉伸,表明存在纤维素和/或酸。酸预处理使该峰增大是由于样品被酸饱和,而HTC处理使该峰显著降低,证实了纤维素结构在消化纤维中由于破坏了纤维素中的氢键而变得疏松。2945 cm处的吸收带与C-H拉伸有关,证实了纤维素的甲基和亚甲基基团在酸和酶预处理后均被部分除去。此外,酶处理样品在1654 cm(C=O拉伸)处峰值强度的降低可能是由于酶水解纤维素导致半纤维素的部分降解。在95℃培养12小时后,HTC在结晶纤维素上的相对活性最大。然而,当孵育时间增加到48小时后,相对活性变化不明显。因此,该酶与纤维素(12h)相比与纤维素(5h)相比,需要更长的时间才能达到其最大活性。综上所述,目前的结果证实了HTC对纤维素及其结晶形态的显著作用,在未来将有广泛的工业应用。

关键词：纤维素酶超耐热酶热稳定性那不勒斯热袍菌生物质螺旋藻

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