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滚环扩增技术在生物分子检测方面的应用研究

滚环扩增技术在生物分子检测方面的应用研究

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作者：尚鑫鑫曲阜师范大学

学位级别：硕士

核酸扩增是生物学和医学的一项非常重要的技术。滚环策略是一种高效,但吸引人的简单方法,用于扩增核酸,生物大分子和信号放大。这种放大策略作为平台的许多方法得到快速发展。鉴于其目前的快速增长,相信滚环扩增的大量新应用将很快出现... 详细信息

核酸扩增是生物学和医学的一项非常重要的技术。滚环策略是一种高效,但吸引人的简单方法,用于扩增核酸,生物大分子和信号放大。这种放大策略作为平台的许多方法得到快速发展。鉴于其目前的快速增长,相信滚环扩增的大量新应用将很快出现,特别是在生命系统中使用纳米载体来编码和检测细胞中的生物活性物质。循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤生长相关基因组和蛋白质组的载有信息的货运载体,是造成大多数癌症相关死亡的重要原因。因此,CTCs的细胞传感已成为了解其在疾病发展中的作用并提供指导治疗的诊断工具的重要课题。生物活性物质在细胞的增殖分化、组织的新陈代谢和生命体的遗传等方面起了不可忽视的作用,所以生物活性物质检测在临床疾病的诊断领域、靶向治疗等方面具有重要意义,因而建立一种简单、快速、灵敏的检测方法日益引人关注,由此成为生物化学领域科研工作者研究的基本和热点对象。一方面我们提出了一种适体和鲁米诺-金纳米粒子功能化的RNA膜作为有效的循环肿瘤细胞的捕获平台和新型ECL增强剂用于生物传感方法,-NH基团的修饰可以使血清中的RNA稳定。由于配体与配体相互作用对纳米结构的影响,RNA膜纳米结构表现出对Romas细胞的强捕获效率。此外,还采用了一种新的增强剂APS用于luAuNPs电化学发光(ECL)。另一方面我们提出一种超树突状滚环转录(HRCT),它仅由一个环状核酸模板组成,该模板包括对分析物RNA的识别序列,与用荧光载体/猝灭剂对修饰的分子信标相同的序列,以及与加在一起的发夹结构的环区相同的序列。我们使用颈环结构的荧光分子信标来传递这种滚环转录的自组装。该系统可以很容易地实现对靶RNA的超灵敏检测。1基于滚环转录形成的含有丰富氨基的RNA膜的平台,通过使用寡核苷酸来进行细胞特异性的捕获和释放并输送抗癌药物阿霉素(DOX)。首先,利用DNA自组装技术原理,通过滚环转录方法,形成RNA纳米膜。在形成的RNA纳米膜的基础上,引入Ramos适配体,可以对Ramos细胞进行特异性捕获,携带DOX的RNA膜对Ramos细胞的选择性药物输送。采用了一种新的增强剂APS用于luAuNPs电化学发光(ECL),将核酸适配体和luAuNPs功能化的RNA膜用于细胞传感。在APS的帮助下,目标细胞可以被检测到。电化学发光强度与靶细胞的数量成正比,其动态范围为50-700个细胞,而且靶细胞的检测限可以低至50个细胞。2基于滚环转录方法形成一个HRCT检测平台,该平台仅一个环状核酸模板组成,当引入分析物RNA来就能够触发一系列的滚环转录,使用颈环结构的荧光分子信标来传递滚环转录的自组装,从而实现生物活性物质的检测。用这种简单的方法,可以定量检测miRNA-21低至1×101818 M。另外通过设计接头DNA中还原性硫醇可切割的二硫键,释放DNA中的接头部分,并成功地应用HRCT原理以显示出对还原硫醇的优异的选择性和灵敏度。

关键词： RNA膜细胞捕获电化学发光增强剂超树突状滚环转录 RNA GSH

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