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斜纹夜蛾caspase-5基因的克隆及其蛋白功能的研究

斜纹夜蛾Caspase-5基因的克隆及其蛋白功能的研究

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作者：闫秀梅华中师范大学

学位级别：硕士

细胞凋亡是一种正常的细胞程序性死亡,哺乳动物中caspase家族在线粒体凋亡通路中起着重要的作用,caspase家族分为两大类:起始caspase和执行caspase。通常,起始caspase的活化导致caspase级联,因此,起始caspase在细胞凋亡通路中具有重要... 详细信息

细胞凋亡是一种正常的细胞程序性死亡,哺乳动物中caspase家族在线粒体凋亡通路中起着重要的作用,caspase家族分为两大类:起始caspase和执行caspase。通常,起始caspase的活化导致caspase级联,因此,起始caspase在细胞凋亡通路中具有重要的作用。哺乳动物中已鉴定多种起始caspase,其中caspase-9是研究较为深入的起始caspase。昆虫中caspase-9同源基因也已鉴定,鱗翅目中的家蚕、舞毒夜蛾以及草地贪夜蛾均已克隆和鉴定出caspase-9同源的起始caspase。我们实验室多年从事斜纹夜蛾(SpodopteraLitura)细胞凋亡研究,为深入研究斜纹夜蛾细胞凋亡信号转导途径,我们克隆了斜纹夜蛾caspase-9同源物Sl-caspase-5基因,原核表达Sl-caspase-5蛋白,制备了相应抗体,初步研究了Sl-caspase-功能,主要研究成果如下:1、Sl-caspase-5基因的克隆,氨基酸序列比对分析及其蛋白功能预测(1)成功克隆的Sl-caspase-5基因全长1587bp,最大的开放阅读框为1338bp。编码445个氨基酸,预测的Sl-caspase-5蛋白质的等电点为6.40,相对分子质量约为51.136Da。(2)Sl-casase-5氨基酸与其他鳞翅目昆虫的起始caspase如家蚕(Bombyx mori)Bm-dronc,棉铃虫(Helicoverpa armfgera)Ha-caspase-5,草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-dronc,舞毒蛾(Lymantria dispar)Ld-caspase-5,果蝇(Drosophila melanogaster)Dm-dronc 等氨基酸的同源一致性分别是 54%,70%,88%,58%和 28%。预测Sl-caspase-5的蛋白三级结构有14个α螺旋,5个p折叠和一些无规卷曲。Sl-caspase-5蛋白在310位半胱氨酸(C)的周围具有保守的五肽序列(QMCRG),N端有募集结构域Card区以及靠近C端的大、小亚基P20和P10构成的活性结构域,结构分析显示Sl-caspose-5属于起始caspase。2、Sl-caspase-5的原核表达与纯化构建了Sl-caspase-重组原核表达载体pET-28-Sl-caspase-5-His6,转化感受态细胞BL-21,IPTG诱导表达,先后采用镍柱纯化和分子筛纯化系统纯化Sl-caspase-5蛋白,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测表明原核表达的Sl-caspase-5蛋白发生了自我剪切。为了阻止Sl-caspase-5的自我剪切,我们将Sl-caspase-5第310位的活性氨基酸半胱氨酸突变成丙氨酸即Sl-caspose-5-C310A,构建原核表达载体pET-28-Sl-caspase-5-C310A-His6,表达纯化获得 Sl-caspase-5 完整的蛋白,以此蛋白作为抗原免疫家兔制备出多克隆抗体。3、Sl-caspase-5具有起始caspase酶活性Sl-caspase-5的大量原核表达中能够自我剪切并活化,为测定其是否具有酶活性特异性,用Ac-IEVD-AFC作为荧光底物,测定了 Sl-cospose-5活性,结果显示它能催化底物分解,焚光光度分析表明Sl-caspfase-5蛋白有较高caspase酶活性。4、Sl-cospfase-5蛋白的功能分析(1)Sl-caspase-5与Apaf-1、效应caspase在离体条件下的相互作用原核表达有活性的Sl-caspase-5蛋白与效应caspase Sl-caspase-1在一定反应缓冲体系下可以发生相互作用,Sl-caspase-1被Sl-cospose-5蛋白切割成相对分子质量约为19 KD和12KD两个亚单位。低温短时间诱导表达无活性的Sl-cospase-5酶原蛋白,在dATP、Apaf-1和Sl-caspase-1 存在条件下,Apaf-1 能够激活Sl-caspase-酶原,将 Sl-caspase-1 切割两个亚单位,此结果与单独的有活性的Sl-caspase-5与Sl-caspase-1相互作用结果一致。在上述体系中另外加入含有Card募集结构域的截短Sl-caspase-5-Card蛋白,Sl-caspase-1又不被切割,提示截短Sl-caspase-5-Card蛋白竞争性与Apaf-1作用,抑制了Sl-caspase-活性,说明 Sl-caspase-5 活化需要 Apaf-1。(2)Sl-caase-5过表达诱导细胞凋亡将带有绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIE2-N1-Sl-caspase-5-GFP、PIE2-N1-Sl-cass

关键词： Sl-caspase-5 细胞凋亡起始caspase 功能预测斜纹夜蛾

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