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蛋白质糖基化抑制剂衣霉素及其与HER2分子靶向性抗体药物赫赛汀联合用药的抗肿瘤作用研究

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蛋白质糖基化抑制剂衣霉素及其与HER2分子靶向性抗体药物赫赛汀联...

作者：韩茜倩山东大学

学位级别：硕士

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一,在乳腺癌病人中普遍存在HER2过度表达的现象。HER2分子是一185kDa的跨膜糖蛋白,针对HER2分子的靶向治疗是近年来出现的一种有效的生物治疗手段。靶点药物如赫赛汀由于靶点专一,使药物对细胞的其它代偿作... 详细信息

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一,在乳腺癌病人中普遍存在HER2过度表达的现象。HER2分子是一185kDa的跨膜糖蛋白,针对HER2分子的靶向治疗是近年来出现的一种有效的生物治疗手段。靶点药物如赫赛汀由于靶点专一,使药物对细胞的其它代偿作用及信号旁路没有抑制作用导致耐药性,大大限制了其应用。因此,靶向药物与其他药物的联合应用是目前研究的热点。衣霉素是一种能够抑制糖蛋白N-糖链合成的抗生素,作为糖蛋白N-糖链合成抑制剂,可以抑制大多数是糖蛋白的受体进行糖基化,进而使受体数量减少和活性降低,HER2信号转导通路以及其它代偿途径随之降低。因此,衣霉素与赫赛汀的联用既可增强赫赛汀的抗肿瘤效果,又能避免细胞毒药物联用时导致的毒副作用。本课题主要选用5种人乳腺细胞株：MCF-7、MCF-7/HER2、SKBR3、BT474以及MCF-10A,通过体内外实验,在动物、细胞及分子各个方面深入研究了衣霉素对乳腺癌细胞的抗肿瘤作用,并从衣霉素对HER2分子及其相关信号传导通路分子表达及活化的影响来探讨了其分子作用的机制。在此基础上,本课题还对衣霉素联合HER2分子靶向药物赫赛汀对乳腺癌的作用进行了初步的探索,为衣霉素与赫赛汀联合用药进入临床试验奠定理论基础。 1HER2真核表达载体pcDNA3.1/HER2以及HER2高表达稳定转染乳腺癌细胞株MCF-7/HER2构建与鉴定采用RT-PCR的方法从人乳腺癌细胞MDA-MB-453中获得HER2的cDNA序列,并将其克隆至载体pGEM(?)-T Easy上,然后测序验证序列的正确性。将质粒pGEM(?)-T Easy/HER2和载体pcDNA3.1分别用限制性内切酶Nhe I和Xho I进行双酶切,然后用T4DNA连接酶连接,成功构建出重组质粒pcDNA3.1/HER2。将重组质粒转染至乳腺癌细胞MCF-7中,通过G418筛选和Western blot鉴定,获得稳定高表达HER2的MCF-7/HER2细胞。该细胞可以作为分子靶点HER2的细胞模型进行下一步的研究。 2衣霉素与赫赛汀单独或者联合用药的体外实验 2.1通过CCK8检测在衣霉素或赫赛汀单独用药或联合用药对细胞增殖的影响结果显示,衣霉素在各种乳腺癌细胞中,均存在剂量依赖性的细胞增殖抑制作用。通过各细胞IC50的比较,我们发现细胞对于衣霉素的敏感性与其HER2表达水平并不相关。赫赛汀单独给药时,除HER2高表达的BT474细胞对其较为敏感,其他细胞如正常无限增殖乳腺上皮细胞MCF-10A, HER2低表达细胞MCF-7对其均不敏感。当固定衣霉素浓度为0.5μg/ml与赫赛汀联用时,联合用药组与空白对照相比,具有明显的抑制细胞增殖的作用,其抑制率高于衣霉素和赫赛汀单独用药组。另外,利用上述实验结果和两药相互作用指数计算公式得知,衣霉素与赫赛汀联合给药处理MCF-/HER2细胞,CDI赫赛汀单独或者联合用药对细胞凋亡的影响通过AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞仪检测衣霉素与赫赛汀单独或者联合用药对细胞凋亡的影响。对两株HER2高表达细胞株,细胞凋亡率随着衣霉素浓度增加而升高,具有一定的剂量依赖性。同时实验证明,随着给药时间的延长,细胞的晚期凋亡率有明显的升高。当衣霉素浓度为0.5μg/ml时,SKBR3细胞的凋亡率由24h时的8.69%升高到48h时的15.57%,MCF-7/HER2细胞的凋亡率由24h时的7.01%升高到48h时的13.62%。赫赛汀单独给药时,随赫赛汀浓度递增,MCF-7/HER2和SKBR3细胞凋亡比率增加。当10μg/ml赫赛汀和100μg/ml赫赛汀单独给药处理24h时,SKBR3细胞的凋亡率分别为7.14%和12.50%,MCF-7/HER2细胞的凋亡率分别为8.74%和9.49%;当100μg/ml赫赛汀和0.5μg/ml衣霉素联用时,SKBR3和MCF-7/HER2细胞的凋亡率分别为14.57%和13.20%。联合给药组的凋亡率要高于单独给药组的凋亡率。因此,衣霉素单独对于该两株细胞有良好的促进细胞凋亡的作用,并且能加强赫赛汀诱导的细胞凋亡作用。对于乳腺癌细胞MCF-7,细胞凋亡率随衣霉素浓度增加而升高,而赫赛汀单独用药对于细胞的凋亡无明显的作用效果。当衣霉素与赫赛汀联合用药时,凋亡率较衣霉素与赫赛汀单独给药组稍有提高,但是并不显著。例如,当浓度为0.5μg/ml的衣霉素和10μg/ml的赫赛汀单药处理细胞24h时,MCF-7细胞凋亡率是4.42%和3.01%;而二者联用时凋亡率是5.10%;当赫赛汀浓度为100μg/ml(?)寸,细胞凋亡率是3.40%,与0.5μg/ml衣霉素联用时凋亡率是5.13%。通过Western blot检

关键词：衣霉素糖基化抑制剂赫赛汀乳腺癌 HER2

Cullin7在乳腺癌赫赛汀耐药中的作用及机制研究

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Cullin7在乳腺癌赫赛汀耐药中的作用及机制研究

作者：何玉芳广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤,20%乳腺癌患者HER-2过表达,当HER-2过表达及其相关信号通路激活导致细胞无限增殖,最终会导致肿瘤容易发生侵袭和转移,预后较差。Herceptin(商品名:赫赛汀)是抗HER-2的人源化单抗,赫... 详细信息

研究背景与目的乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤,20%乳腺癌患者HER-2过表达,当HER-2过表达及其相关信号通路激活导致细胞无限增殖,最终会导致肿瘤容易发生侵袭和转移,预后较差。Herceptin(商品名:赫赛汀)是抗HER-2的人源化单抗,赫赛汀的出现使很多HER-2阳性的乳腺癌患者得到显著的疗效,但经常会在使用了一年左右开始出现赫赛汀耐药,使得治疗失败。虽然对于赫赛汀耐药机制的探索已经历了十多年,但至今仍未完全解决赫赛汀耐药。因此,彻底阐明赫赛汀耐药机制将有助于提高HER-2阳性乳腺癌病人的生存率。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性细胞的细胞,越来越多的证据证实肿瘤干细胞的存在是肿瘤耐药的重要原因之一。乳腺癌中也被证实由于乳腺癌干细胞的存在,使得乳腺癌更易复发并且趋于难治。大量研究报道表明,Hedgehog信号通路的激活能增强乳腺癌干细胞特性。Liu等人发现了在乳腺癌干细胞上IHH、SMO、Gli1、Gli2的表达明显高于已分化的肿瘤细胞,阻断Hedgehog信号通路后能明显减少微球体的形成,证实了乳腺癌干细胞中的Hedgehog信号通路被激活[1]。Tanaka等人发现,从乳腺癌细胞株MCF-7中分选出CD44+CD24-细胞中的SHH、Gli1高表达,通过加入SMO抑制剂环巴胺培养72h后,CD44+CD24-在MCF-7中的比例明显降低[2]。近年来也有文献报道TGF-β/Smads信号通路激活也能增强肿瘤干细胞特性。从三阴性乳腺癌CD44+CD24-的干细胞群、干性标志物、干细胞样间质细胞表型、干细胞自我更新能力以及侵袭能力等方面证实了TGF-β1可以增强三阴性乳腺癌干细胞自我更新能力等干细胞特性[3]。Hedgehog及TGF-β/Smads信号通路中的多个重要成分都可以被泛素化调节。在Hedgehog信号通路的激活过程,跨膜受体PTCH与SHH配基结合并内化入细胞,同时SMO富集到原纤毛中,这种膜受体内吞转运的过程中,泛素化修饰,特别是多位点的单泛素化修饰是促进膜受体内化转运的关键信号之一。在TGF-β/Smads信号通路激活的过程中,Smurfs是一类含有HECT结构域的E3泛素连接酶,是一种能特异性介导Smads分子泛素化降解的调节因子。CUL家族作为体内重要的泛素化酶E3的主要骨架,与泛素激活酶E1、泛素转移酶E2共同组成泛素-蛋白酶体系统(ubiqutin-proteasomesystem,USP),具有调节细胞周期、凋亡,细胞增殖和信号转导方面的作用,在蛋白质修饰中也有重要的意义,其中由CUL与SKP1、Fbx29(也称为Fbw8)、ROC1组成了SCF-ROC1样E3泛素连接酶复合物是整个泛素化过程关键的结构[4]。我们前期的研究发现,无论是在乳腺癌组织还是在乳腺癌细胞中,CUL7的表达与乳腺癌恶性程度呈正相关,即CUL7高表达的乳腺癌组织或者乳腺癌细胞,其侵袭、转移的能力明显增强;同时,体外抑制CUL7的表达明显削弱乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而肿瘤耐药和转移并不是孤立的两个过程。研究发现,在细胞膜表达的P-gp和CD44分子可以通过直接相互作用,影响了肿瘤细胞的耐药性及转移侵袭能力,表明P-gp的高表达有助于增强肿瘤细胞的存活及转移侵袭能力,提示了耐药与转移侵袭之间存在着密切的关系,及其存在的复杂多样的调控因素[5-6]。在我们的预实验中,通过比较HER-2阳性乳腺癌赫赛汀耐药细胞(SKBR3/POOL2)和亲本细胞(SKBR3)中CUL7的表达,发现CUL7在HER-2阳性乳腺癌耐药细胞中也呈现高表达。有限的研究证实,赫赛汀耐药的胃癌细胞获得了肿瘤干细胞样表型[7]。因此,我们推测CUL7作为CUL家族的一员,可能也通过泛素化调控Hedgehog、TGF-β/Smads信号通路的相关分子,促进肿瘤干细胞生成,诱发乳腺癌赫赛汀耐药。故本实验将通过RT-PCR、Western-Blot、基因干扰实验、免疫荧光实验、细胞流式等技术、以及免疫组化及裸鼠体内实验等,从多个方面证实CUL7对乳腺癌赫赛汀耐药的影响,并初步探讨其可能的分子机制。研究方法1.选取HER-2阳性乳腺癌赫赛汀耐药细胞(SKBR3/POOL2)和亲本细胞(SKBR3),并通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术检测两组细胞中CUL7 mRNA和蛋白表达水平;2.构建CUL7 shRNA慢病毒载体,通过嘌呤霉素筛选得到稳定干扰CUL7表达的细胞株(SKBR3/POOL2-shRNA)和阴性对照(SKBR3/POOL2-NC);并通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术检测SKBR3/POOL2-shRNA和SKBR3/POOL2-NC中CUL7 mRNA和蛋白表达水平;***法

关键词：乳腺癌耐药 Cullin7 赫赛汀肿瘤干细胞

HER2阳性乳腺癌患者术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗的MTDH、TopoⅡ表达与预后关系的探讨

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HER2阳性乳腺癌患者术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗的MTDH、TopoⅡ...

作者：蔡丽静河北医科大学

学位级别：硕士

目的:分析HER2阳性乳腺癌患者术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗和术前单纯新辅助化疗两组患者中MTDH、TopoⅡ的表达与临床病理特征及预后关系的探讨。方法:筛选河北医科大学第四医院自2009-2017年间行术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗乳腺癌患... 详细信息

目的:分析HER2阳性乳腺癌患者术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗和术前单纯新辅助化疗两组患者中MTDH、TopoⅡ的表达与临床病理特征及预后关系的探讨。方法:筛选河北医科大学第四医院自2009-2017年间行术前新辅助化疗联合赫赛汀治疗乳腺癌患者147例为实验组,随访成功144例,同期术前单纯新辅助化疗患者145例为对照组,随访成功137例,所有患者均经免疫组织化学染色或FISH检测证实为HER2阳性或扩增,完全病理缓解(PCR)患者中无肿瘤组织,故剔除PCR患者,使用术后组织对MTDH及TopoⅡ蛋白进行免疫组织化学染色。分析两种不同治疗方案患者MTDH、TopoⅡ表达与临床病理特征及预后的关系。采用SPSS21.00进行统计学分析,卡方检验进行相关性分析,Kaplan-Meier进行生存分析,Cox单因素、多因素回归分析,P赫赛汀(实验组)患者1年、3年、5年OS分别为95.1%、92.1%、83.7%,1年、3年、5年DFS分别为92.1%、79.2%、77.1%;术前单纯新辅助化疗(对照组)患者1年、3年、5年OS分别为94.5%、78.2%、72.7%;1年、3年、5年DFS分别为90.3%、63.8%、49.0%,两者之间均有显著差异,差异有统计学意义(P0.05);Ki67有48例患者发生了改变,其中46例高表达转低表达,2例低表达转高表达,HER2有15例发生患者有阳性转为阴性,差异有统计学意义(P0.05);Ki67有40例患者发生了改变,其中31例高表达转低表达,9例低表达转高表达,HER2有13例由阳性转为阴性,差异有统计学意义(P0.05)。4.相关性分析结果表明,实验组中MTDH高表达率为44.74%(51/114),低于对照组MTDH高表达率58.06%(72/124),差异有统计学意义(P赫赛汀组的预后好于单纯术前新辅助化疗组。2.新辅助化疗联合赫赛汀Ki67的表达水平变化较单纯新辅助化疗显著降低,而ER、PR、HER2的表达水平变化较单纯新辅助化疗无显著变化,并且新辅助化疗联合赫赛汀组中PCR患者明显高于较单纯新辅助化疗显著增高,表明新辅助化疗联合赫赛汀治疗的效果好于单纯新辅助化疗。3.实验组与对照组中MTDH和TopoⅡ的表达情况均存在差异;且MTDH与TopoⅡ表达情况之间正性相关

关键词：乳腺癌新辅助化疗赫赛汀预后 MTDH TopoⅡ

赫赛汀治疗HER-2高表达晚期乳腺癌的观察和护理

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天津护理 2010年第1期18卷 13-14页

作者：李娜汪洋天津医科大学附属肿瘤医院天津300060

总结8例晚期乳腺癌患者应用赫赛汀治疗的护理,加强健康教育,严格遵守操作规程,注意用药观察,是患者顺利完成整个治疗过程的重要保障。

关键词：赫赛汀 HER-2高表达晚期乳腺癌护理

赫赛汀联合多西紫杉醇治疗Her-2阳性晚期转移性乳腺癌的临床观察

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交通医学 2015年第4期29卷 366-367,370页

作者：刘凡沈浮南通大学附属医院肿瘤化疗科江苏226001

目的：观察赫赛汀联合多西紫杉醇治疗Her-2阳性晚期转移性乳腺癌的疗效及毒副反应。方法：收集经病理组织学诊断的晚期转移性乳腺癌患者25例，经免疫组织化学染色法显示Her-2（＋＋＋）或Fish方法检测显示Her-2过表达，接受赫赛汀联合... 详细信息

目的：观察赫赛汀联合多西紫杉醇治疗Her-2阳性晚期转移性乳腺癌的疗效及毒副反应。方法：收集经病理组织学诊断的晚期转移性乳腺癌患者25例，经免疫组织化学染色法显示Her-2（＋＋＋）或Fish方法检测显示Her-2过表达，接受赫赛汀联合多西紫杉醇治疗。赫赛汀以负荷剂量8mg/kg，静脉滴注，随后第22天起每3周以6mg/kg给药，静脉滴注。联合多西紫杉醇75mg/m2，静脉滴注＞1小时，d1。使用多西紫杉醇前常规予地塞米松、西米替丁、异丙嗪预处理。上述方案每3周为1周期，至少治疗2个周期，两周期无进展的患者给予4-6周期治疗，观察疗效和毒副反应。结果：所有患者均完成3-6个周期化疗，可评价疗效。全组患者中CR2例，PR14例，SD5例，PD4例，ORR为64.0%，DCR为84.0%，中位PFS为10.8月（95%CI：9.7-11.3个月），1年生存率88.0%。毒副反应主要为骨髓抑制、消化道反应、周围神经毒性、乏力，多为1-2级，患者可以耐受，经对症处理，不影响继续化疗。第一次输注赫赛汀后有3例患者出现寒战、发热，经对症处理后缓解，1例因治疗至8月出现LVEF〈50%而停药。结论：赫赛汀联合多西紫杉醇治疗Her-2阳性晚期转移性乳腺癌的疗效确切，毒副反应轻微，患者耐受性较好，值得临床进一步研究推广。

关键词：转移性乳腺癌赫赛汀多西紫杉醇人类表皮生长因子受体-2 化学治疗

赫赛汀治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌的观察和护理

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岭南现代临床外科 2007年第5期7卷 360-361页

作者：宋淑芬龚敏佘晓佳深圳市第二人民医院乳腺外科

目的探讨赫赛汀治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌出现的毒副作用的观察及对其采取的护理。方法使用赫赛汀前对患者进行全面评估(特别是心功能状况),准确的用药疗程和计量,对所需药物的稀释液进行妥善保管,对用药过程中所产生不良反应作... 详细信息

目的探讨赫赛汀治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌出现的毒副作用的观察及对其采取的护理。方法使用赫赛汀前对患者进行全面评估(特别是心功能状况),准确的用药疗程和计量,对所需药物的稀释液进行妥善保管,对用药过程中所产生不良反应作相应观察和积极护理。结果全部6例病例中,2例有轻度恶心,头痛,乏力,腹泻不适;3例出现轻微乏力及血象降低予以对症处理后缓解;1例患者出现轻度的心慌,胸闷不适予以护心对症处理后缓解(患者用药前心功能三级)。结论赫赛汀治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌效果良好;通过严格遵循操作原则,确保准确的计量和疗程,妥善的药物保管,积极地观察和护理,可以明显地降低药物所引起的不良反应,使治疗的过程中病人的生活质量明显提高。

关键词：赫赛汀转移性乳腺癌观察和护理

赫赛汀与健择以序贯方式联合应用对乳腺癌细胞抑制作用的研究

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中国药物应用与监测 2006年第5期3卷 40-44页

作者：吴志勇焦顺昌解放军总医院肿瘤内科北京100853

目的:探讨赫赛汀与化疗药物健择联合作用于乳腺癌细胞时,在进行化疗的同时何时应用赫赛汀疗效最好及赫赛汀对于化疗药物作用的影响,从而为临床治疗提供实验依据。方法:利用MTT法测定单纯赫赛汀组、单纯化疗组以及不同时间点的赫赛汀结... 详细信息

目的:探讨赫赛汀与化疗药物健择联合作用于乳腺癌细胞时,在进行化疗的同时何时应用赫赛汀疗效最好及赫赛汀对于化疗药物作用的影响,从而为临床治疗提供实验依据。方法:利用MTT法测定单纯赫赛汀组、单纯化疗组以及不同时间点的赫赛汀结合化疗组对人乳腺癌细胞(MDA-MB543)的抑制率。结果:赫赛汀与健择联合作用时,各序贯方式与单药健择相比无明显差别(P=0.447),健择作用6h后应用赫赛汀的序贯方式有拮抗作用的趋向,其抑制率(40.18%)低于单药(42.91%),其他序贯方式略高于单药,以两药同时使用时抑制率最高(48.78%)。赫赛汀对于健择的抑制率的影响,各种序贯方式均使健择对于细胞的抑制作用减弱,即发挥拮抗作用,尤其健择作用6h后应用赫赛汀的序贯方式抑制率为26.40%,明显低于单药健择的42.91%(P赫赛汀后健择的序贯方式拮抗作用略弱于先健择后赫赛汀的序贯方式。结论:赫赛汀与健择联合没有明显提高健择对乳腺癌细胞的毒性作用,两药同时使用的序贯方式略优于其他序贯方式及单药健择;在各种序贯方式中,赫赛汀对健择起拮抗作用,健择使用后6h应用赫赛汀此拮抗作用最强,先健择后赫赛汀及同时使用的序贯方式的拮抗作用较弱。

关键词：赫赛汀化疗健择 MDA-MB543细胞株

赫赛汀治疗Her-2阳性乳腺癌的疗效与毒性观察

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心电图杂志（电子版） 2017年第4期6卷 137-138页

作者：石慧张家港市澳洋医院江苏张家港215600

目的探讨分析赫赛汀对Her-2阳性乳腺癌的治疗效果及毒性作用。方法按照治疗方式的不同将我院纳入的58例Her-2阳性乳腺癌患者分为A组、B组、C组,其中A组22例,采用常规化疗药物治疗,B组18例,单纯应用赫赛汀治疗,C组18例,给予赫赛汀联合多... 详细信息

目的探讨分析赫赛汀对Her-2阳性乳腺癌的治疗效果及毒性作用。方法按照治疗方式的不同将我院纳入的58例Her-2阳性乳腺癌患者分为A组、B组、C组,其中A组22例,采用常规化疗药物治疗,B组18例,单纯应用赫赛汀治疗,C组18例,给予赫赛汀联合多西他赛治疗,比较三组临床疗效及毒性反应。结果 A组、B组、C组临床治疗近期总有效率分别为18.19%、55.00%、83.33%,B组高于A组(P0.05)。结论单纯应用赫赛汀及与化疗药物联合应用治疗Her-2阳性乳腺癌均能取得较好治疗效果,但与化疗药物联合应用效果更为显著,且不会增加毒性作用。

关键词：赫赛汀 Her-2阳性乳腺癌毒性

赫赛汀靶向治疗HER-2过度表达乳腺癌的效果及护理

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中国医药指南 2018年第1期16卷 215-216页

作者：张晓春辽宁省铁岭市中心医院肿瘤内科二病房辽宁铁岭112000

目的分析HER-2过度表达乳腺癌患者应用赫赛汀进行靶向治疗的临床效果及护理方法。方法将我院收治的54例HER-2过度表达乳腺癌患者随机分为两组,不使用赫赛汀,仅使用常规化疗药物的为对照组,联合应用包括赫赛汀在内的多种化疗药物,并给予... 详细信息

目的分析HER-2过度表达乳腺癌患者应用赫赛汀进行靶向治疗的临床效果及护理方法。方法将我院收治的54例HER-2过度表达乳腺癌患者随机分为两组,不使用赫赛汀,仅使用常规化疗药物的为对照组,联合应用包括赫赛汀在内的多种化疗药物,并给予针对性护理干预(包括正确配置赫赛汀、合理贮藏药品等)为观察组。统计两组患者的治疗效果,并进行对比。结果观察组患者的治疗缓解率(88.9%)明显高于对照组(48.1%),数据差异较大,P赫赛汀靶向治疗,并给予其针对性护理干预,可充分发挥出药物的作用,减少不良反应的发生,达到缓解病灶的目的。

关键词： HER-2过度表达乳腺癌赫赛汀护理