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中国农业科学 2022年第18期55卷 3675-3684页

作者：贾雅婷胡慧慧翟亚军赵冰何坤潘玉善胡功政苑丽河南农业大学动物医学院

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌Inc FⅡ质粒为研究对象，探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制，为控制Inc FⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌(p BAD25922、F2... 详细信息

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌Inc FⅡ质粒为研究对象，探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制，为控制Inc FⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌(p BAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns)的生长曲线，比较hns对菌株的影响情况；分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌，大肠埃希菌J53(耐叠氮钠)为受体菌，进行接合试验，并计算接合频率；采用实时荧光定量PCR检测各重组菌(F25922、FΔhns和FΔhns/phns)中Inc FⅡ质粒接合转移相关基因(tra M、tra J和tra Y)的m RNA表达量；构建Lac Z融合报告菌株F25922/P(P/P)、FΔhns/P(P/P)和FΔhns/phns/P(P/P)，分别测定不同菌株中3种基因(tra M、tra J和tra Y)启动子P、P和P的β-半乳糖苷酶活性；构建H-NS蛋白原核表达载体，采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白，PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列，利用电泳迁移率变动分析试验(EMSA)探明核蛋白H-NS调控Inc FⅡ质粒接合作用的调控方式，预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和p BAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异，说明质粒p BAD和Inc FⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长；但是，缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922，表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差，但不影响菌株的存活。接合试验结果显示，FΔhns中Inc FⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1 279.33倍(P质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平，但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示，FΔhns中tra基因(tra M、tra J和tra Y)的m RNA表达量均极显著高于对照菌株(P质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示，H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移，说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合；通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证，证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与Inc FⅡ质粒的tra M、tra J和tra Y的启动子区的AT富集区结合，抑制启动子活性，从而导致启动子下游相关转移基因tra M、tra J和tra Y的表达量下降，结果明显抑制Inc FⅡ质粒的接合转移。

关键词： H-NS tra基因 IncFⅡ质粒质粒接合作用负调控鸡大肠埃希菌

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核蛋白H-NS和双组份信号转导系统CpxAR协调调控IncFⅡ质粒接合的分子机制

核蛋白H-NS和双组份信号转导系统CpxAR协调调控IncFⅡ质粒接合的...

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作者：胡慧慧河南农业大学

学位级别：硕士

质粒介导耐药基因水平散播是导致细菌耐药基因在菌属间广泛散播的最常见途径。IncFⅡ质粒是多重耐药大肠埃希菌中常见的接合型质粒之一,它的接合受多种因素的调控,其中全身/局部调节蛋白（如H-NS、CpxAR和Tra等）的调控作用尤为重要。但... 详细信息

质粒介导耐药基因水平散播是导致细菌耐药基因在菌属间广泛散播的最常见途径。IncFⅡ质粒是多重耐药大肠埃希菌中常见的接合型质粒之一,它的接合受多种因素的调控,其中全身/局部调节蛋白（如H-NS、CpxAR和Tra等）的调控作用尤为重要。但是,尚不清楚H-NS和CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合的分子机制。本研究以多重耐药鸡大肠埃希菌的IncFⅡ质粒为研究对象,利用Red同源重组分别构建大肠杆菌ATCC25922的cpxR和hns一系列基因缺失株及其回补菌株,进行药物敏感性分析,分别将携带blacTX-M-65、fosA3和rmtB耐药基因的IncFⅡ质粒电转入上述构建的菌株中,最终获得含有IncFⅡ质粒的8种重组菌。通过微量肉汤稀释法测定了各重组菌株的抗菌药物敏感性、生长曲线测定和质粒稳定性测定,以及IncFⅡ质粒和回补菌株中pBAD质粒的拷贝数,其次,以J53为受体菌,进行接合试验,计算接合频率,分析重组菌的质粒接合作用特征。同时,利用荧光定量PCR检测重组菌中与质粒接合转移相关tra、接合转移可育性抑制因子Fino、主动外排泵基因arcA、外膜蛋白ompA的相对mRNA表达水平;最后将可能受调控基因启动子区PY、PJ、PM序列连接到报告质粒,构建报告菌株,进行β-半乳糖苷酶活性测定,分析cpxR和hns对启动子的调控作用。通过药敏结果显示,cpxR能够影响大肠杆菌对多西环素的敏感性。hns可以负调控大肠杆菌对庆大霉素抗菌活性,也可能影响大肠杆菌对多西环素、氨苄西林的敏感性。另外,cpxR基因的缺失对细菌的生长速度无明显影响,hns基因的缺失导致细菌生长适应性变差,细菌的生长速度变慢。pEC01 1质粒在双缺失菌株FΔcpxRΔhns中稳定性较差;接合频率结果显示,cpxR和hns对IncFⅡ型质粒pEC0 11接合转移均呈负调控作用。IncFⅡ型质粒pEC0 11在双基因缺失株FAcpxRΔhns的接合频率介于两单缺FΔcpxR和FAhns之间。cpxR与hns对IncFⅡ型质粒的调控呈拮抗作用:相对mRNA表达量结果显示,大肠杆菌的H-NS可显著下调接合转移tra相关基因ttraJ、traY、traM、traL、traF、traE、traA的mRNA表达量,且对traJ和traE的调控作用更强。CpxR可显著下调traY、traJ、traM的mRNA表达量,也可上调traL、traE、fino的mRNA表达量,对traF、ompA、acrA无明显调控作用。回补菌株FΔcpxR/pcpxR和FΔhns/phns对所有待测基因的mRNA的相对表达量均有不同程度的恢复。更进一步证明,CpxAR与H-NS在调控tra相关基因中呈拮抗作用;β-半乳糖苷酶活性结果显示,cpxR可减弱tra相关启动子PY、PJ、PM的活性。hns也可减弱tra相关启动子PY、PJ、PM的活性。且对PY启动子调控作用更强。双基因缺失株对三个启动子的活性均处于两单缺失株之间,说明cpxR和hns对启动子PY、PJ、PM活性的调控呈拮抗作用。综上所述,核蛋白H-NS和双组份信号转导系统CpxAR对IncFⅡ质粒pEC011的接合转移呈拮抗作用,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平快速散播提供理论依据。

关键词： CpxAR H-NS tra基因 IncFⅡ质粒质粒接合作用调控机制

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