检索结果-南通市图书馆

作者：卫慢扬州大学

学位级别：硕士

猪链球菌是一种重要的人兽共患病原菌,猪和人类感染会导致脑膜炎、败血症甚至死亡。金属是生物的必需营养物质,然而过量的金属对细菌是有毒的。因此维持细胞内金属稳态对细菌的生存至关重要。在本研究中,我们在猪链球菌中鉴定了一个金... 详细信息

猪链球菌是一种重要的人兽共患病原菌,猪和人类感染会导致脑膜炎、败血症甚至死亡。金属是生物的必需营养物质,然而过量的金属对细菌是有毒的。因此维持细胞内金属稳态对细菌的生存至关重要。在本研究中,我们在猪链球菌中鉴定了一个金属调节因子TroR。猪链球菌在添加过量锰条件下的转录组测序结果显示,troR和troABCD操纵子的表达均显著下调。生物信息学分析发现猪链球菌的TroR蛋白与化脓链球菌、肺炎链球菌、格氏链球菌、副血链球菌和变形链球菌的同源蛋白有大约54%到60%的一致性。生长曲线结果显示,相比野生株（WT）和互补株（CΔtroR）,troR基因缺失株（ΔtroR）在添加锌（Zn）、钴（Co）和铜（Cu）的培养基中生长受到抑制;在Zn或Co过量时,锰（Mn）的补充缓解了ΔtroR的生长缺陷;在用Chelex处理的培养基中添加不同浓度的Mn,ΔtroR的生长也受到了抑制。电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）结果显示,在添加Mn、Co、Cu和Zn的培养基中,ΔtroR中Mn和Co的积累量比WT和CΔtroR高,说明troR能维持猪链球菌锰和钴的稳态。通过对WT和ΔtroR的转录组测序分析发现,与WT相比,ΔtroR中共有20个基因显著差异表达,其中troABCD操纵子显著上调,说明TroR负调控troABCD操纵子。荧光定量PCR显示,亚铁[Fe（Ⅱ）]和Co诱导WT中troA的表达,Mn和Cu抑制其表达;troA的抑制是由TroR介导的。小鼠鼻内感染模型结果显示,与WT和CΔtroR相比,ΔtroR对各组织的定殖能力减弱,说明troR的缺失减弱了猪链球菌的毒力。以上结果表明,TroR是TroABCD系统的负调节因子,并与猪链球菌抵抗金属毒性和毒力有关。构建猪链球菌基因缺失株最常用的方法是基于pSET4s温敏型自杀质粒的同源重组法。但该方法没有用到负筛选标记,筛选突变株需要花费大量时间。也有研究人员基于猪链球菌自然转化,构建了无需基因克隆的基因缺失法,但该方法产生的突变株携带抗性基因（即有痕）,不能用于后续的疫苗研究。前期研究发现,在大肠杆菌中诱导副溶血性弧菌YoeB毒素（YoeBVp）的表达会导致细胞死亡,推测YoeB Vp可以作为猪链球菌的一种负筛选标记。在本研究中我们首先评估了YoeB Vp的负筛选能力。将yoeBVp基因与铜诱导的启动子PcopA重叠成一个DNA片段,再将该片段克隆到猪链球菌-大肠杆菌穿梭载体pSET2中,利用自然转化法导入猪链球菌中,来评估YoeB Vp的表达对猪链球菌生长的影响。荧光定量PCR结果显示铜能显著诱导yoeBVp的表达。生长曲线和斑点稀释实验表明,在液体培养基和琼脂平板中,YoeBVp的表达都抑制了猪链球菌的生长,表明YoeBVp有潜力成为猪链球菌的负筛选标记。随后,我们构建了由壮观霉素抗性基因（spc）为正筛选标记,PcopA启动子驱动的副溶血弧菌YoeB毒素编码基因（PcopA-yoeBVp）为负筛选标记组成的基因盒,命名为SCIY盒。利用该基因盒,结合猪链球菌自然转化,成功地建立了一种新的猪链球菌两步无痕基因缺失法。最后利用该方法成功且高效地构建了猪链球菌ΔpmtA、ΔperR和ΔlysR。该方法不需要基因克隆,具有较高的效率;此外,该方法也可用于定点突变或缺失猪链球菌基因组中的少数几个碱基。综上所述,本研究通过构建troR基因缺失株和互补株,对TroR介导的猪链球菌抗金属毒性和致病性进行了探讨,发现TroR影响猪链球菌的抗金属毒性和毒力。检测了 YoeBVp毒素在猪链球菌中的负筛选潜力,通过构建的spc-PcopA-yoeBVp基因盒,结合自然转化法,成功建立了一种新的猪链球菌两步无痕基因缺失法。

关键词：猪链球菌 TroR 金属毒性毒力负筛选标记无痕基因缺失

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微生物基因组精简优化的研究进展

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生物工程学报 2013年第8期29卷 1044-1063页

作者：王建莉王小元江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

微生物基因组精简优化是构建合成生物学底盘细胞的重要策略。文中从基因组精简的整体设计出发,归纳了微生物的必需基因及其确定方法,重点介绍了各种微生物基因组精简策略,分析了多种基因组精简菌株的特点,充分展示了基因组精简优化在构... 详细信息

微生物基因组精简优化是构建合成生物学底盘细胞的重要策略。文中从基因组精简的整体设计出发,归纳了微生物的必需基因及其确定方法,重点介绍了各种微生物基因组精简策略,分析了多种基因组精简菌株的特点,充分展示了基因组精简优化在构建合成生物学底盘细胞中的重要作用。

关键词：基因组精简必需基因最小基因组无痕基因组敲除负筛选标记底盘细胞合成生物学

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枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术研究进展

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微生物学通报 2015年第12期42卷 2440-2447页

作者：朱旭军李一凡李杨付晶王智文陈涛天津大学化工学院生物工程系天津300072 天津大学教育部系统生物工程重点实验室天津300072

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的模式生物,长期以来在代谢工程和工业微生物领域扮演重要角色。枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术对后基因组时代的基因功能研究和菌株生理特性的改造起着关键作用。综述枯草芽孢杆菌无标记遗传操作所使用的... 详细信息

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的模式生物,长期以来在代谢工程和工业微生物领域扮演重要角色。枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术对后基因组时代的基因功能研究和菌株生理特性的改造起着关键作用。综述枯草芽孢杆菌无标记遗传操作所使用的负筛选标记基因,总结目前主流的无标记遗传操作的策略,并提出枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术面临的主要问题和发展方向。

关键词：枯草芽孢杆菌无标记遗传操作负筛选标记同源重组位点特异性重组

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谷氨酸棒杆菌无痕基因修饰系统的构建

谷氨酸棒杆菌无痕基因修饰系统的构建

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作者：马雯雯天津大学

学位级别：硕士

谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌株,广泛应用于医药、食品及饲料等行业。其生长快速,适应性好,具有作为新型细胞工厂的潜力,有着广阔的应用前景。然而相比大肠杆菌,酿酒酵母等模式生物,其基因修饰技术相对滞后。本研究首先针对目... 详细信息

谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌株,广泛应用于医药、食品及饲料等行业。其生长快速,适应性好,具有作为新型细胞工厂的潜力,有着广阔的应用前景。然而相比大肠杆菌,酿酒酵母等模式生物,其基因修饰技术相对滞后。本研究首先针对目前基因修饰系统中转化子假阳性率高的问题,引入新的有效负筛选标记,并结合双链断裂重组技术,构建基因无痕修饰的双交换重组系统。在此基础上,借助大肠杆菌重组酶,实现了双链PCR片段对基因组的无痕修饰。在谷氨酸棒杆菌中,主要采用质粒pK18mobsacB进行基因的修饰,但是sacB作为负筛选标记基因存在假阳性高的问题。本研究中首先通过比较谷氨酸棒杆菌野生型菌株(WT)与upp基因敲除型(WT-Δupp)菌株对致死物质5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐受性,验证了upp基因作为负筛选标记的可行性。在相同Ptrc启动子调控下,upp较sacB有较低的假阳性率,降低了约10倍。证明了其更适合作为谷氨酸棒杆菌基因操作系统中的负筛选标记。并进一步确定了upp作为负筛选标记时,致死物5-FU的最佳筛选浓度为100μM。通过构建含有upp负筛选盒子的通用质粒载体pCupp,IPTG诱导表达I-Sce I核酸内切酶的辅助质粒pEC-XK99E-Sce I-recET,进一步将upp负筛选标记与I-SceI核酸内切酶介导的双链断裂重组技术相结合,组建双交换重组系统,成功实现了目标基因ldhA的敲除。I-Sce I核酸内切酶的表达对负筛选盒子弹出效率具有重要影响,最佳的IPTG诱导浓度为1.5 mM,最佳诱导时间为24 h,该条件下,负筛选盒子弹出的效率为3.68×10-5。通过阿拉伯糖诱导辅助质粒pEC-XK99E-Sce I-recET表达大肠杆菌重组酶RecE/RecT,转化敲除目的基因ldhA所需的PCR片段,首次在谷氨酸棒杆菌中实现了利用双链DNA片段对基因组的操作。辅助质粒pEC-XK99E-SceI-recET可通过无抗生素压力下传代消除,不会对细胞后续的基因操作产生影响。

关键词：谷氨酸棒杆菌负筛选标记同源重组 I-SceI Red/ET重组

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