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三角帆蚌新发现的贝壳基质蛋白基因hic9的分离、鉴定及其在珍珠早期形成过程中的作用

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水产学报 2019年第4期43卷 782-789页

作者：刘晓军郭炜金参白志毅李家乐上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海海洋大学E研究院

为进一步研究珍珠质形成的分子机理,使用RACE-PCR技术从三角帆蚌外套膜中克隆到一个新的贝壳基质蛋白基因hic9。RT-PCR和原位杂交技术结果显示,hic9主要在闭壳肌和外套膜中表达,且在外套膜外褶的外表皮各部分都有信号,在壳皮沟中同样有... 详细信息

为进一步研究珍珠质形成的分子机理,使用RACE-PCR技术从三角帆蚌外套膜中克隆到一个新的贝壳基质蛋白基因hic9。RT-PCR和原位杂交技术结果显示,hic9主要在闭壳肌和外套膜中表达,且在外套膜外褶的外表皮各部分都有信号,在壳皮沟中同样有信号,这些结果表明,hic9是一个同时参与了贝壳角质层、棱柱层和珍珠层形成的多功能基质蛋白基因。hic9富含甘氨酸(14.81%)、脯氨酸(13.58%)和丙氨酸(12.35%),在序列中部形成"Gly-X-X"的结构(X为任意氨基酸),与近C末端连续重复丙氨酸结构(polyA)一起使hic9具有类似蛛丝蛋白的结构特征。hic9 C末端由一段疏水性序列"LAWMLFV"组成,推测这段序列形成β折叠结构,紧邻该序列89～91位是"Asp-Leu-Asp"序列,这是一个典型的Ca2+结合位点。此外,通过实时定量PCR检测了珍珠形成早期阶段hic9在初生珍珠囊中的表达情况,插片后3～15 d hic9在珍珠囊中的表达水平维持在大致相同的表达水平,在碳酸钙沉积物从无序向有序转变时期(18～25 d),表达水平较第15天有显著的升高,这表明hic9参与了这一过程,在珍珠层的形成过程中发挥了关键作用。

关键词：三角帆蚌生物矿化贝壳基质蛋白珍珠层珍珠

厚壳贻贝转凝蛋白类贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2020年第5期46卷 539-550页

作者：姜雨婷孙琦徐焕志申望张晓林范美华廖智浙江海洋大学海洋科学与技术学院海洋生物蛋白质工程研究室浙江舟山316022

为探明从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳肌棱柱层中鉴定的一种新型贝壳基质蛋白——转凝蛋白类蛋白(transgelin-like protein,TLP)在贝壳形成过程中可能的分子机制,在序列分析基础上,对厚壳贻贝TLP进行原核重组表达及其表达产物的纯化... 详细信息

为探明从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳肌棱柱层中鉴定的一种新型贝壳基质蛋白——转凝蛋白类蛋白(transgelin-like protein,TLP)在贝壳形成过程中可能的分子机制,在序列分析基础上,对厚壳贻贝TLP进行原核重组表达及其表达产物的纯化,并分析其对方解石型和文石型碳酸钙晶体形貌的诱导作用及对晶型的影响,同时,分析其对2种晶型碳酸钙晶体结晶速度的抑制及结合作用。序列分析结果显示,厚壳贻贝TLP含有一段钙调理蛋白同源(calponin homology,CH)结构域,其三级结构以α-螺旋结构域为主。功能分析结果表明,重组厚壳贻贝TLP能诱导方解石型和文石型碳酸钙晶体在形貌上产生变化,其中:对方解石型碳酸钙晶体的晶型具有向文石型转化的作用,但对文石型碳酸钙晶体的晶型无影响。重组TLP对方解石型碳酸钙晶体的结晶速度具有明显的抑制作用,而对文石型碳酸钙晶体的结晶速度在蛋白质量浓度较高时具有促进作用。此外,重组TLP具有结合方解石型碳酸钙晶体的作用,但与文石型碳酸钙晶体无明显结合。以上结果表明,TLP对贝壳的形成具有影响并可能在贝壳肌棱柱层的形成中起到了重要作用。

关键词：转凝蛋白类蛋白钙调理蛋白同源结构域贝壳基质蛋白生物矿化

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

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广东海洋大学学报 2019年第1期39卷 22-29页

作者：黄荣莲范闪闪杜晓东广东海洋大学水产学院//广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心广东湛江524088

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交... 详细信息

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。

关键词：马氏珠母贝贝壳基质蛋白原位杂交 RNA干扰

三角帆蚌类丝状基质蛋白基因silkmaxin的克隆及其在贝壳和珍珠生物矿化中的作用

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水产学报 2019年第12期43卷 2449-2458页

作者：夏中慧刘晓军李家乐上海洋大学农业农村部淡水种质资源重点实验室上海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室

贝壳基质蛋白指导了珍珠形成过程中碳酸钙的成核、晶体生长和晶型选择等关键过程。为进一步研究珍珠形成的分子机理,本实验使用RACE-PCR技术克隆得到一个新的贝壳基质蛋白基因,并命名为silkmaxin。组织表达分析和原位杂交分析表明,该蛋... 详细信息

贝壳基质蛋白指导了珍珠形成过程中碳酸钙的成核、晶体生长和晶型选择等关键过程。为进一步研究珍珠形成的分子机理,本实验使用RACE-PCR技术克隆得到一个新的贝壳基质蛋白基因,并命名为silkmaxin。组织表达分析和原位杂交分析表明,该蛋白于外套膜缘膜部外上表皮组织特异性表达,证明silkmaxin基因所编码的蛋白属于珍珠层基质蛋白。silkmaxin基质蛋白氨基酸序列富含甘氨酸(Gly,33.0%)和丝氨酸(Ser,10.4%),蛋白结构由β-折叠构成,类似丝状蛋白结构。分析珍珠形成早期珍珠囊中该蛋白基因的表达发现,silkmaxin基因在珍珠囊内碳酸钙沉积物从无序到有序的转变过程中起了重要作用。通过RNA干扰实验可知,贝壳基质蛋白是珍珠层文石小片正常生长不可缺少的因子,当silkmaxin基因表达被抑制,文石小片的成核、大小和形状均发生了改变。

关键词：三角帆蚌生物矿化贝壳基质蛋白类丝状蛋白珍珠

马氏珠母贝棱柱层相关基质蛋白基因的克隆及功能研究

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马氏珠母贝棱柱层相关基质蛋白基因的克隆及功能研究

作者：范闪闪广东海洋大学

学位级别：硕士

贝壳基质蛋白（Shell Matrix Proteins,SMPs）是贝壳形成的主要参与者和功能执行者,在有机框架构建和矿物沉积过发挥重要作用。本课题组前期通过对马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）贝壳基质蛋白质组分析,获得了棱柱层SMPs。本... 详细信息

贝壳基质蛋白（Shell Matrix Proteins,SMPs）是贝壳形成的主要参与者和功能执行者,在有机框架构建和矿物沉积过发挥重要作用。本课题组前期通过对马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）贝壳基质蛋白质组分析,获得了棱柱层SMPs。本研究对其中的5个SMPs基因进行全长克隆,并通过q RT-PCR、原位杂交（ISH）、RNAi和原核表达技术进行功能验证。结果如下:1、β-N-乙酰-己糖胺酶（Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX）属于糖苷水解酶20家族（GH20）,是几丁质代谢的关键水解酶。几丁质作为有机框架主要成分,其代谢在贝壳矿化中发挥重要作用。本研究克隆获得2个β-N-乙酰-己糖胺酶基因Pm HEX和Pm HEXL。Pm HEX全长3 813 bp,编码1 141个氨基酸;Pm HEXL全长2 760bp,编码774个氨基酸;二者均含有两个典型的GH20和GH20b结构域和一个碳水化合物结合结构域（CHB-HEX）。QRT-PCR分析表明Pm HEX和Pm HEXL在外套膜边缘区（ME）和套膜区（MP）均显著高表达,ISH检测显示Pm HEX和Pm HEXL均主要定位于边缘区外褶和套膜区的外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm HEX在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调（P＜0.05）;且贝壳棱柱层和珍珠层微观结构都出现不同程度的紊乱。因此,Pm HEX参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。2、几丁质结合蛋白在与几丁质特异性结合、钙化调控等过程发挥重要作用。通过克隆获得马氏珠母贝几丁质结合蛋白（Chitin binding protein,CBP）Pm CBP基因全长序列6 367 bp,编码2 044个氨基酸,包含20个典型的Cht BD2结构域（CBDs）,且Cht BD2结构域在物种间具有较高的保守性。QRT-PCR分析表明Pm CBP在外套膜套膜区表达量最高（P＜0.05）;ISH分析显示Pm CBP基因主要分布于外套膜套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm CBP在外套膜套膜区的表达量显著下调,且贝壳珍珠层结构生长紊乱。相关性分析发现Pm CBP的表达水平与壳重和壳长呈正相关（P＜0.05）。因此,Pm CBP参与了贝壳珍珠层的形成。3、本研究克隆获得马氏珠母贝含表皮生长因子样结构域的蛋白（Epidermal growth factor-like domain-containing protein,EGFCP）Pm EGFCP（PU12）基因全长1 394 bp,编码363个氨基酸,具有2个保守的表皮生长因子样结构域（Epidermal growth factor-like domain,EGF）、一个透明带结构域（Zona pellucida domain,ZP）。QRT-PCR分析表明Pm EGFCP在外套膜边缘区和套膜区著高表达（P＜0.05）;ISH检测显示Pm EGFCP主要定位于边缘区外褶外侧和中褶内侧以及套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后Pm EGFCP在边缘区的表达量显著下调,且贝壳棱柱层结构生长紊乱,珍珠层正常。因此,Pm EGFCP参与了贝壳棱柱层的形成。通过构建p ET32a-Pm EGFCP的原核表达载体,成功诱导表达了Pm EGFCP重组蛋白,Western blot检测其带有His标签,且与预测分子量大小一致。经复性浓缩冻干获得3mg的Pm EGFCP重组蛋白。4、本研究克隆获得马氏珠母贝没有功能注释的壳基质蛋白基因Pm-PNU7全长序列797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的“KGG”重复序列和富含天冬氨酸（Asp）序列“DDDDDDHDD”。QRT-PCR分析表明Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达（P＜0.05）;ISH检测显示Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。因此,Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。

关键词：马氏珠母贝棱柱层贝壳基质蛋白 RNAi 原核表达

贝类闭壳肌-贝壳连接界面的分子组成及连接机制

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浙江海洋大学学报（自然科学版） 2018年第4期37卷 313-319,326页

作者：廖智孙琦姜雨婷浙江海洋大学海洋科学与技术学院浙江舟山316022

贝类贝壳是一种生物矿化组织,其优异的力学性能使之成为生物材料学研究的重要模型,贝壳的组成分子主要包括约95%的碳酸钙晶体以及5%的有机质,其微观结构由具不同晶型和形貌的碳酸钙晶体组合而成;贝壳基质蛋白作为贝壳形成的关键性分子,... 详细信息

贝类贝壳是一种生物矿化组织,其优异的力学性能使之成为生物材料学研究的重要模型,贝壳的组成分子主要包括约95%的碳酸钙晶体以及5%的有机质,其微观结构由具不同晶型和形貌的碳酸钙晶体组合而成;贝壳基质蛋白作为贝壳形成的关键性分子,对贝壳的力学性能有着重要贡献。贝类闭壳肌与贝壳的连接界面因为涉及到有机相-无机相之间的生物粘附,在生物医学工程方面同样具有重要的研究意义。但目前相关的研究还不多见,已有的报道主要围绕闭壳肌-贝壳连接界面的微观结构及蛋白质分子组成开展。贝类闭壳肌主要连接于贝壳肌棱柱层,两者之间存在一层有机质膜,形成闭壳肌-膜-肌棱柱层的连接体系,而贝壳基质蛋白,特别是肌棱柱层特有的蛋白在该界面连接中可能发挥着重要作用。

关键词：贝壳闭壳肌贝壳基质蛋白肌棱柱层闭壳肌-贝壳连接界面

厚壳贻贝贝壳CLP-2和GRSP蛋白的结构与功能研究

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厚壳贻贝贝壳CLP-2和GRSP蛋白的结构与功能研究

作者：孙琦浙江海洋大学

学位级别：硕士

软体动物贝壳的生物矿化过程受到多种贝壳基质蛋白的调控,形成的生物矿化产物并具有良好的力学性能,因此成为了生物工程领域和仿生材料领域学研究的重要对象。贝壳基质蛋白通过调控碳酸钙晶体的成核和生长过程,从而促使贝壳形成有规则... 详细信息

软体动物贝壳的生物矿化过程受到多种贝壳基质蛋白的调控,形成的生物矿化产物并具有良好的力学性能,因此成为了生物工程领域和仿生材料领域学研究的重要对象。贝壳基质蛋白通过调控碳酸钙晶体的成核和生长过程,从而促使贝壳形成有规则的纳米结构并赋予贝壳极强的机械性能。因此,通过多种方法进一步探究贝壳基质蛋白的功能,对分析贝壳的形成过程及这类蛋白对生物矿化的影响有重要意义。本研究以我国具有重要经济价值的贝类——厚壳贻贝为研究材料,鉴定并表征了肌棱柱层特有的两个新型贝壳基质蛋白,分别为collagen-like protein 2（CLP-2）和Gln-rich shell protein（GRSP）。通过开展序列分析、构建原核表达体系、qRT-PCR、原位杂交、体外碳酸钙结晶、免疫荧光、Pull-down等多种手段探索上述两种蛋白在贝壳形成过程中可能的潜在作用。序列分析结果表明厚壳贻贝CLP-2基因序列全长1 640 bp,编码453个氨基酸,具有一段信号肽和两个VWA结构域,理论分子量50.1 kDa,理论等电点pI7.10。GRSP基因的开放阅读框1 788 bp,编码595个氨基酸,含一个PDZ结构域和一个ZM结构域,理论分子量67.7 kDa,理论等电点pI 9.37,是一种碱性蛋白。荧光定量PCR结果表明,CLP-2基因在厚壳贻贝的外套膜中有较高表达量,而GRSP基因在厚壳贻贝的足组织中有较高表达量;原位杂交结果表明两种蛋白均在外套膜边缘和后闭壳肌组织底部（靠近贝壳内表面区域）检测到阳性信号。利用场发射扫描电镜和傅里叶红外光谱分析上述两种贝壳基质蛋白的重组产物对方解石以及文石型碳酸钙晶体在形貌和晶型方面的影响。结果表明rCLP-2和rGRSP蛋白可诱导碳酸钙晶体的形貌发生改变,并促进文石型晶体的形成;结晶抑制实验结果表明,上述两种蛋白的加入可导致方解石晶体的结晶速率下降。采用Pull-down技术结合LC-MS/MS质谱分析分别鉴定CLP-2和GRSP的相互作用蛋白。其中,CLP-2鉴定到15种互作蛋白,GRSP鉴定到18种互作蛋白。此外,通过生物膜干涉技术分别探究了重组CLP-2和GRSP蛋白与Actin的相互作用,结果仅检测到了GRSP与肌动蛋白的亲和力。上述结果表明,CLP-2和GRSP对贝壳的生物矿化过程和超分子化学组成具有重要影响并可能在贝壳肌棱柱层的形成中起到了关键作用。

关键词：厚壳贻贝贝壳贝壳基质蛋白胶原蛋白生物矿化

基于Illumina平台的厚壳贻贝外套膜转录组从头测序

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2015年第4期41卷 394-406页

作者：鲍林飞王新星何健瑜范美华高鹏廖智浙江海洋学院海洋科学与技术学院海洋生物资源及分子工程实验室浙江舟山316022

为了解贻贝贝壳基质蛋白的分子多样性,采用Illumina高通量测序平台,对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)外套膜组织开展转录组文库构建及从头测序研究,总计产出6 970 102 920nt数据,共77 445 588条干净阅读子;经序列拼接与组装,获得厚壳贻贝... 详细信息

为了解贻贝贝壳基质蛋白的分子多样性,采用Illumina高通量测序平台,对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)外套膜组织开展转录组文库构建及从头测序研究,总计产出6 970 102 920nt数据,共77 445 588条干净阅读子;经序列拼接与组装,获得厚壳贻贝外套膜转录组单一基因共计106 452个,总长55 222 289nt,平均长度519nt,N50达到754nt;并对上述单一基因进行了生物学功能注释和聚类分析。为进一步挖掘贻贝贝壳基质蛋白相关基因,通过对单一基因的序列注释以及利用已知贝壳基质蛋白序列进行本地搜索,共鉴定出与12种已知贝壳基质蛋白同源的厚壳贻贝外套膜单一基因124条。通过对厚壳贻贝贝壳基质蛋白单一基因进行序列分析和比较,发现厚壳贻贝与其他软体动物,如鲍属、牡蛎属和珠母贝属等在贝壳基质蛋白组成以及序列上具有一定的保守性,暗示着贝壳基质蛋白可能具有共同的起源;同时,首次从贻贝属中发现了3种贝壳棱柱层特异的贝壳基质蛋白单一基因。这为后续贻贝贝壳基质蛋白的大规模鉴定以及对贝壳形成机制的探讨奠定了基础。

关键词：厚壳贻贝外套膜贝壳基质蛋白转录组

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长牡蛎贝壳形成相关蛋白及其基因的研究

长牡蛎贝壳形成相关蛋白及其基因的研究

作者：宋小瑞中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：硕士

贝壳基质蛋白(shell matrix protein, SMP)是软体动物双壳类贝壳中的主要有机成分。在贝壳形成过程中，基质蛋白调控CaCO3晶体的形成并赋予贝壳特殊的性能，因此对贝壳基质蛋白的研究一直是在分子水平上研究贝壳形成机理的重要内容之一... 详细信息

贝壳基质蛋白(shell matrix protein, SMP)是软体动物双壳类贝壳中的主要有机成分。在贝壳形成过程中，基质蛋白调控CaCO3晶体的形成并赋予贝壳特殊的性能，因此对贝壳基质蛋白的研究一直是在分子水平上研究贝壳形成机理的重要内容之一。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象，从基因克隆入手，分离得到了两类与贝壳形成密切相关的基因。其中第一类为nacrein相关基因，分别编码nacrein-like proteins F1，F2和F3。序列分析发现，三个蛋白均具有α-CA(Carbonicanhydrase)的特征，含有28个CA活性位点，包括三个与Zn2+结合的His残基，但是α-CA结构域被串联重复序列插入分为两个亚单位。其中nacrein-like proteinsF1和F2为分泌性蛋白。进化分析显示，nacrein-like proteins在物种形成之后，发生基因复制现象，具有多个拷贝，并且在双壳纲和腹足纲中产生分化。RT-PCR结果揭示nacrein-like proteins F1和F2在多器官中均有表达，但在外套膜中表达量相对较高。在长牡蛎个体发育中，nacrein-like proteins F1和F2的表达量分别在幼贝和稚贝达到最高，而这一趋势与贝壳中方解石相晶体的比重增长趋势基本一致，推测二者可能与方解石相晶体的形成有关。另一类pif基因编码的蛋白含有VWFA(Von Willebrand factor type A domain)和CHITINDI(Chitin-binding type-2domain)两个典型的保守结构域。VWFA结构域是Pif97蛋白中行使蛋白-蛋白相互作用的功能位点，具有支撑及细胞粘附作用。CHITINDI结构域则能促使与几丁质的结合。Pif是目前发现的唯一同时含有上面两个典型的结构域的分子，并且某些pif分子中含有多个VWFA或CHITINDI结构域，表明pif分子也存在基因复制现象。进化分析表明，pif分子在双壳纲和腹足纲中没有产生明显的分化。RNAi结果显示pif97的表达受到抑制后，贝壳内表面的形貌发生明显的改变，推测其功能主要结合几丁质框架并促使片层结构的形成。

关键词：贝壳基质蛋白长牡蛎 nacrein-like proteins VWFA结构域 CHITBINDII结构域