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豆豉溶栓酶肠溶片剂的制备及体外释放度

中国医药工业杂志 2006年第7期37卷 476-477,491页

作者：陶琳涂泽琰刘德清屈廷启吴思方湖北工业大学生物工程学院湖北省益康制药厂湖北武汉430064 武汉华珍药业有限公司湖北武汉430051

采用均匀设计优化豆豉溶栓酶肠溶片片芯的制备工艺。结果表明,按优化处方经工艺过程制得的片芯酶活性损失仅6%。包肠溶衣后的制品在0.1mol/L盐酸中2h平均累积释放率为2.1%;在0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)中,23.4min累积释药50%,45min释... 详细信息

采用均匀设计优化豆豉溶栓酶肠溶片片芯的制备工艺。结果表明,按优化处方经工艺过程制得的片芯酶活性损失仅6%。包肠溶衣后的制品在0.1mol/L盐酸中2h平均累积释放率为2.1%;在0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)中,23.4min累积释药50%,45min释药86.3%,释药规律符合Weibull分布模型。

关键词：豆豉溶栓酶肠溶片均匀设计体外释放度

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豆豉溶栓酶溶栓作用的初步研究

营养学报 2007年第2期29卷 195-196页

作者：庞庆芳张炳文刘晓婷蔺新英山东农业大学食品学院泰安271018 济南大学食品科学与营养系济南250002 山东大学公共卫生学院济南250001

豆豉是我国的传统大豆发酵食品。1987年须见洋行博士首次从日本豆豉中提取纯化出一种具有溶解交联纤维蛋白功能的纳豆激酶（NK），该酶能显著溶解体内外血栓，且无毒副作用，有望成为一种新型的血栓溶酶。研究人员在我国传统豆豉中也提... 详细信息

豆豉是我国的传统大豆发酵食品。1987年须见洋行博士首次从日本豆豉中提取纯化出一种具有溶解交联纤维蛋白功能的纳豆激酶（NK），该酶能显著溶解体内外血栓，且无毒副作用，有望成为一种新型的血栓溶酶。研究人员在我国传统豆豉中也提取出了具有溶栓功能的酶类，但对其溶栓作用的研究鲜见报道。

关键词：豆豉溶栓酶体外溶栓抗血栓

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豆豉溶栓酶提取纯化研究

食品研究与开发 2007年第8期28卷 79-82页

作者：姚晓玲孟凡涛吴思方湖北工业大学生物工程学院湖北武汉430068

对豆豉溶栓酶发酵液进行提取、脱色,盐析,超滤脱盐,冷冻干燥等纯化研究,制得的豆豉溶栓酶干品,其比活力为530.6U/mg,纯化倍数为11.0,活性回收率为65.7%。溶栓酶干品经Sephadex G-100柱层析,SDS-PAGE法测定分子量为31.0ku。

关键词：豆豉溶栓酶纯化比活力

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豆豉溶栓酶的研究新进展

中国调味品 2011年第4期36卷 10-13页

作者：卢露索化夷西南大学食品科学学院重庆400715 重庆市特色食品工程技术研究中心重庆400715

豆豉溶栓酶是豆豉中的某些微生物在发酵过程中产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。跟传统的一些溶栓药物相比,它不仅具有很强的溶血栓能力,还具有安全性好、成本低、口服有效等优点,极有可能开发为新一代的溶栓剂。论文重点对金属离子以及酶... 详细信息

豆豉溶栓酶是豆豉中的某些微生物在发酵过程中产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。跟传统的一些溶栓药物相比,它不仅具有很强的溶血栓能力,还具有安全性好、成本低、口服有效等优点,极有可能开发为新一代的溶栓剂。论文重点对金属离子以及酶抑制剂对豆豉溶栓酶的理化性质影响、豆豉溶栓酶高产菌种选育方法、溶栓酶生物活性及酶制剂产品开发等最新研究成果进行了综述。为深入研究豆豉溶栓酶的特性,进一步开发豆豉溶栓酶产品提供了科学研究基础。

关键词：豆豉溶栓酶理化性质生物活性高产菌种选育产品开发

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豆豉溶栓酶基因的克隆表达及其体外进化研究

豆豉溶栓酶基因的克隆表达及其体外进化研究

作者：刁苗福建农林大学

学位级别：硕士

血栓病是严重危害人类健康的疾病之一,由血栓症引起的心,脑血管疾病在死亡率的排名中居二、三位,这就使得溶栓药物以及具有溶栓功能的保健食品的研制得到迅速发展。微生物溶栓酶作为一种新的溶酶,在理论和临床上都有一定的应用价值,并... 详细信息

血栓病是严重危害人类健康的疾病之一,由血栓症引起的心,脑血管疾病在死亡率的排名中居二、三位,这就使得溶栓药物以及具有溶栓功能的保健食品的研制得到迅速发展。微生物溶栓酶作为一种新的溶酶,在理论和临床上都有一定的应用价值,并对我国医药生物技术发展具有积极意义。本实验室已经成功地从豆豉中分离筛选到一株溶栓酶活力高的菌株,并命名为枯草芽孢杆菌LD-8547。本试验通过PCR从豆豉中筛选出来的产豆豉溶栓酶的枯草芽孢杆菌中扩增豆豉溶栓酶的编码基因片段,连接到pET-28a(+)载体上,再转化到E. coli BL21 (DE3)宿主菌中。将阳性克隆子用IPTG进行诱导表达。结果表明:成功构建了重组菌E. coli BL21/pET28a-fe。诱导表达后,将表达好的菌液进行超声破碎,上镍柱纯化后进行酶活检测,结果表明显示E. coli BL21/pET28a-fe表达的蛋白有溶栓酶的活性。对E. coli BL21/pET28a-fe进行SDS-PAGE分析显示,在E. coli BL21/pET28a-fe中有两条蛋白带,其大小分别为60 kDa和28 kDa,对比细胞破碎后沉淀和上清中的条带可以发现,60 kDa的蛋白只存在与细胞破碎后的沉淀中,而在上清中没有发现,而28 kDa的蛋白在沉淀和上清中都有存在。为了提高重组溶栓酶的活力,本试验通过易错PCR和交错延伸技术对豆豉溶栓酶的编码基因进行了改造。并将得到的突变基因连接到pET-28a(+)载体上,再转化到E. coli BL21 (DE3)宿主菌中,对得到的重组菌进行两步筛选,结果筛选到4株相对于出发菌株酶活显著提高的重组菌。为了将突变酶和野生酶进行比较,以枯草芽孢杆菌的发酵液为材料,对豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对得到的野生酶和突变酶分别进行了动力学分析。动力学分析表明,得到的四种突变酶的Km值和野生酶的Km相近,而Mut 1的Km值小于野生酶的Km,说明相对于野生酶,Mut 1对底物的亲和力有了稍许提高。与野生酶的Kcat进行比较,四个突变酶的Kcat值都有所提高,说明对底物的催化能力得到了提高。而与野生酶的Kcat/Km相比,Mut 1, Mut 2, Mut 3,这三个突变酶的Kcat/Km值都有所提高,说明它们对底物的催化能力相对于野生酶来说得到了一定的提高。但Mut 4的Kcat/Km相对于野生酶却又一定程度的下降,主要是由于它的Km过高,可能是由于该酶对底物的亲和力下降所致。

关键词：豆豉溶栓酶枯草芽孢杆菌易错PCR 交错延伸技术

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豆豉溶栓酶的分离纯化及酶学性质研究

豆豉溶栓酶的分离纯化及酶学性质研究

作者：庞庆芳山东农业大学

学位级别：硕士

豆豉是我国传统的药食两用资源,溶栓酶是其中重要的生理活性物质。本研究首先对14种豆豉产品的溶栓活性进行比较,然后对细菌型豆豉的代表产品――山东临沂豆豉(半成品)进行深入研究。探索了豆豉溶栓酶的分离纯化条件;确定了纤维蛋白平... 详细信息

豆豉是我国传统的药食两用资源,溶栓酶是其中重要的生理活性物质。本研究首先对14种豆豉产品的溶栓活性进行比较,然后对细菌型豆豉的代表产品――山东临沂豆豉(半成品)进行深入研究。探索了豆豉溶栓酶的分离纯化条件;确定了纤维蛋白平板法与水解酪蛋白法测定溶栓酶酶活的相关性;最后通过动物试验证实了溶栓酶在体内、外的溶栓作用。主要试验结果如下:1.利用纤维蛋白平板法对14种传统豆豉产品的溶栓活性物质进行研究。结果表明,豆豉提取物的溶栓活性范围为0.326～161.972尿激酶单位/mL。永川毛霉型豆豉提取物表现出的活性最大,达161.972尿激酶单位/mL,曲霉豆豉与辣豆豉活性较小。2.豆豉溶栓酶的分离纯化试验首先确定了硫酸铵沉淀豆豉溶栓酶饱和度为75%,其纯化倍数为6.56倍,回收率61.69%;不同离子交换剂对溶栓酶的吸附效果不同,在所选的两种离子交换剂中,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析更适合于溶栓酶的分离纯化,得到纯化倍数为9.87倍的豆豉溶栓酶酶液,回收率为35.6%;最后经过Sephadex G-75凝胶过滤,得到较纯的豆豉溶栓酶,最终纯化倍数为11.29倍,回收率为6.55%。SDS-PAGE凝胶电泳显示,经纯化后的酶无杂蛋白,初步鉴定其分子量接近31KD。3.豆豉溶栓酶酶学性质建立了一种更为简便直观的测定方法――水解酪蛋白法,并用该法测定豆豉溶栓酶的酶学性质,该酶最适作用温度为60℃,pH7～8时酶活性最高。豆豉溶栓酶在pH6～10的范围内稳定性较强,在25℃和37℃下,酶在4h内基本没有活性损失。高于45℃时酶活下降很快,60℃、0.5h酶活基本丧失。由试验结果看出,该酶没有明显的金属离子激活剂,高浓度的Cu2+、Fe3+、Al3+对酶有抑制作用;添加蛋白胨、明胶可以提高酶的活性。抑制剂PMSF对豆豉溶栓酶抑制率几乎达到100%,EDTA、β-巯基乙醇对酶活几乎无抑制作用。4.动物试验豆豉溶栓酶对血块的体外溶解试验结果表明:豆豉溶栓酶高、低剂量组对血块的溶解率均明显高于对照组(P均为0.000),并

关键词：豆豉溶栓酶分离纯化离子交换凝胶层析酶学性质动物试验

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大孔树脂纯化豆豉溶栓酶的工艺优选

中国实验方剂学杂志 2014年第11期20卷 30-33页

作者：王鹏娇孟小夏张敏蒋建民高秀丽贵阳医学院贵阳550004 贵州秀生堂医药生物有限公司贵阳550004

目的:优选豆豉溶栓酶的大孔树脂纯化工艺。方法:以湿比吸附量为指标筛选大孔树脂型号;以豆豉溶栓酶比活性为指标,采用单因素试验考察吸附性能(上样体积、吸附时间)和洗脱性能(洗脱剂种类、洗脱剂pH、洗脱速度、洗脱剂体积),利用SDS-PAG... 详细信息

目的:优选豆豉溶栓酶的大孔树脂纯化工艺。方法:以湿比吸附量为指标筛选大孔树脂型号;以豆豉溶栓酶比活性为指标,采用单因素试验考察吸附性能(上样体积、吸附时间)和洗脱性能(洗脱剂种类、洗脱剂pH、洗脱速度、洗脱剂体积),利用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行分析。结果:HPD-400型大孔树脂对豆豉溶栓酶具有很好的吸附作用,优选的工艺条件为上样量2 BV,吸附时间2 h,加水2 BV洗去杂质,加pH 8.0的Tris-HCl-30%乙醇缓冲液4 BV以2 BV·h-1流速洗脱;豆豉溶栓酶比活性2 254.29 IU·mg-1,纯化数44.17倍,发酵液20 mL平均可得到蛋白质2.86 mg,电泳检测显示豆豉溶栓酶呈现单一条带,相对分子质量28 kD。结论:HPD-400型大孔树脂可用于豆豉溶栓酶的分离纯化,优选的工艺条件稳定可行。

关键词：大孔树脂豆豉溶栓酶纯化工艺湿比吸附量比活性