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ERIC-PCR及全自动核糖体分型法鉴定不同来源的解朊金黄杆菌

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食品工业科技 2020年第1期41卷 105-111,118页

作者：田敏冯震曲瑞丹黄静戚稼禹曹杰华东师范大学生命科学学院上海200241 上海城建职业学院健康与社会关怀学院上海201415 上海市食品药品检验所上海201203

目的:为了建立一种高效分离筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌的筛选方法,采用肠道基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)和全自动核糖体分型方法对来自不同环境的33株解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)进行分子分型研究。方... 详细信息

目的:为了建立一种高效分离筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌的筛选方法,采用肠道基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)和全自动核糖体分型方法对来自不同环境的33株解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)进行分子分型研究。方法:采用ERIC国际通用引物对33株解朊金黄杆菌进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,使用NTsys软件对电泳图进行聚类分析。同时,采用全自动核糖体分型方法对33株解朊金黄杆菌进行核糖体分型,采用Bionumeric软件对菌株进行聚类分析。结果:两种方法均可得到清晰的指纹图谱,可对33株解朊金黄杆菌进行分子分型。ERIC-PCR可扩增出3~9个100~10000 bp之间的条带,将菌株分为2个族群。全自动核糖体分型方法可将菌株分为2个亚型,每种亚型间菌株仍有细微差异。结论:同种菌株之间同源性达到99%以上,但仍在遗传进化关系上存在差异。来自同一地区的分离株有聚类成一类的趋势,且与菌株的产酶能力存在密切关联。研究结果表明聚类于族群Ⅱ的菌株基本都来自于河南,且该类群菌株的产酶能力明显高于族群Ⅰ。

关键词：解朊金黄杆菌 ERIC-PCR 全自动核糖体分型基因分型

高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌诱变育种

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高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌诱变育种

作者：何灿华东师范大学

学位级别：硕士

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-Glutaminase, PG, EC3.***.1.44)是属于谷氨酰胺酶一类新酶种,只对蛋白质或多、短肽上的侧链氨基起作用,在提高植物蛋白特性如溶解性、起泡性等方面具有明显作用,在食品工业上有极大应用前景。目前国内产蛋白质... 详细信息

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-Glutaminase, PG, EC3.***.1.44)是属于谷氨酰胺酶一类新酶种,只对蛋白质或多、短肽上的侧链氨基起作用,在提高植物蛋白特性如溶解性、起泡性等方面具有明显作用,在食品工业上有极大应用前景。目前国内产蛋白质谷氨酰胺酶(PG)的菌株产量低、酶活低,限制了PG的工业化生产。为提高PG酶活,本文以产PG的解朊金黄杆菌Q9、Y8作为研究对象,建立不同体系的发酵方法,紫外诱变方法、亚硝酸钠(nitrite, NIT)诱变方法;为了提高初筛过程中筛选与检测的效率,.本文同时研究了高通量筛选与检测方法,目的以传统诱变与高通量筛选相结合的方式快速筛选目的菌株,为实现PG工业化奠定基础。本研究得出的主要结论如下：(1)不同发酵体系方法的建立微量发酵(初筛体系)：48深孔板每孔装液量为1mL,培养14h后测定酶活,发酵变异系数仅14.7%;复筛体系(试管体系)：复筛体系选用规格为25mm×100mm的粗试管,装液量为3mL,培养12h后测定酶活;诱变验证(摇瓶体系)：摇瓶装液量为20mL/250mL,培养12h测定酶活;选取酶活高且遗传稳定性良好的菌株作为下一轮诱变的出发菌株。(2)从微量发酵到摇瓶验证的发酵放大发酵体积从48深孔板的1mL逐级扩大,放大3倍至试管发酵,放大20倍至摇瓶发酵,深孔板发酵体系与装液量为3mL试管发酵结果相关系数R2=0.73;与20mL/250mL摇瓶发酵相关系数R2高达0.78,装液量为3mL试管复筛体系与20mL/250mL摇瓶相关系数R2达0.9以上,三种逐级放大发酵体系稳定且相关性高,多孔发酵用于诱变初筛可提高筛选速度,节约实验成本。(3)物理及化学诱变育种方法的建立紫外诱变方法：出发菌株Y8,辐照距离30cm,诱变时间10s,致死率为99.31%,正突变率为33%,初筛样本量共650株,酶活最大幅度提高150%;出发菌株Y8,辐照距离45cm,诱变时间10s,致死率为80%,正突变率为35%,初筛样本量共557株,酶活最大幅度提高145%;NIT诱变方法：出发菌株Q9,最佳作用条件：NIT浓度0.6mg/mL,致死率为99%,正突变率为30.4%。初筛中样本量400株,酶活最大幅度提高88%。(4)高通量筛选及快速酶活检测方法甲胺压力筛选方法：在固体LB培养基或液体培养基中添加0.04%-0.05%的甲胺可抑制解朊金黄杆菌单菌落的生长,将甲胺压力筛选应用到紫外诱变的初筛中,在甲胺液体培养基中生长出的单菌落其酶活高于出发菌株的准确率为65%,明显提高了筛选得到正突变率菌株的概率。快速检测酶活方法：通过借助酶标仪动态检测96孔板中PG与底物产生氨的最大速度ΔmaxV,对于不同浓度的标准PG样品,ΔmaxV与酶活间呈显著正相关(R2=0.999),故可用ΔmaxV代替酶活进行快速测定。选用96孔板作为快速测量体系,标准PG样品与发酵液在96孔板内部60孔中ΔmaxV变异系数分别为10%与18%。利用该方法进行亚硝酸钠(nitrite, NIT)诱变,初筛中随机选择的菌株其酶活与AmaxV相关系数R2达0.89。(5)诱变库的建立及高产菌株获得与鉴定紫外诱变三轮,得到的高产菌Y8-UV3-80438,传代8次平均酶活0.9U/mL,相比出发菌株Y8稳定提高125%,Y8-UV3-80412传代8次平均酶活0.93U/mL,相比出发菌株Y8稳定提高133%,NIT诱变三轮得到Q9-NIT3-121412,稳定性良好,传代变异系数为8%,酶活相比于出发菌株至少提高了63%。Y8-UV3-80438. Y8-UV3-804122、Q9-NIT3-121412经PCR测序结果显示其PG酶核苷酸序列未发生改变、氨基酸序列同样未发生改变,诱变位点可能出现在基因的非编码区。

关键词：解朊金黄杆菌蛋白质谷氨酰胺酶发酵放大诱变育种高通量筛选与检测

蛋白酶缺陷型解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的诱变选育及其性质分析

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蛋白酶缺陷型解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的...

作者：郭瑞琪华东师范大学

学位级别：硕士

全球水产行业快速发展,鱼粉资源需求增加,过度的海洋渔业捕捞行为对海洋生态平衡造成不良影响。鱼粉中未能被充分利用的氮、磷元素进入水体,造成水体富营养化,破坏生态环境。因此,积极寻找成本低、绿色健康的植物蛋白替代饲料中的鱼粉... 详细信息

全球水产行业快速发展,鱼粉资源需求增加,过度的海洋渔业捕捞行为对海洋生态平衡造成不良影响。鱼粉中未能被充分利用的氮、磷元素进入水体,造成水体富营养化,破坏生态环境。因此,积极寻找成本低、绿色健康的植物蛋白替代饲料中的鱼粉对于维持水产养殖和生态保护协调发展至关重要。本研究使用食品行业中广泛应用的蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)处理豆粕,克服豆粕自身不足,提高溶解度,探究其替代鱼粉在水产饲料行业中应用的可行性。后续对解朊金黄杆菌TM1040进行诱变育种,获得蛋白酶缺陷菌株,并对其发酵工艺进行优化及酶学性质分析,为PG的大规模工业化生产、应用奠定基础,研究主要内容如下:(1)建立PG工业纯化方案本研究首先确定了解朊金黄杆菌TM1040的生长代谢曲线和发酵产酶曲线,掌握其生长代谢规律。通过硫酸铵沉淀和乙醇沉淀对粗酶液中的PG进行分离纯化,确定硫酸铵饱和度70%沉淀3 h、添加4倍粗酶液体积的无水乙醇(沪试)沉淀3 h的最佳工业纯化PG的条件。(2)优化豆粕替代鱼粉在饲料中的应用本研究利用前期获得的PG粗纯样品和商品PG分别对豆粕进行酶解处理,部分替代饲料中的鱼粉蛋白,对鲫鱼苗开展为期8周的饲养试验。结果显示,经由PG粗纯样品、商品PG处理过的豆粕较其直接在饲料中替代鱼粉应用时,鱼苗的生长性能、消化道酶活性及水体环境质量均有显著改善(P解朊金黄杆菌的诱变育种前期研究中发现,粗纯样品中有蛋白酶残留,对PG的稳定性及后续脱酰胺作用的发挥具有不良影响。本研究通过紫外诱变、NTG诱变对TM1040菌株展开了多轮递推式诱变,共计初筛了3468株菌,复筛111株菌,最终筛选到一株蛋白酶显著降低的菌株N310,其PG酶活为5.19±0.02 U/m L,较出发菌株提升了10.92%,蛋白酶活为229.37±11.43 U/m L,较出发菌株下降了68.66%。(4)蛋白酶缺陷菌株N310的发酵工艺优化通过单因素实验、爬坡实验、CCD响应面实验优化得到的最佳发酵培养基配方为:复合碳源0.10%(葡萄糖:乳糖=1:4),多聚蛋白胨1.72%,磷酸氢二钠0.017%,磷酸二氢钾0.489%,七水合硫酸镁0.25%,七水合硫酸亚铁0.06%,优化后的酶活为6.022 U/m L,与优化前相比提高了16.03%。(5)蛋白酶缺陷菌株N310的纯化效果及酶学性质分析N310菌株蛋白酶显著减少,其纯化效率、纯化样品中PG的稳定性以及对底物蛋白的改性效果较TM1040均有显著改善。此外,对N310纯化的PG进行了酶学性质分析,其最适反应温度为50℃,在20～50℃间酶活稳定性较好,静置1 h后仍能保持85%以上的酶活。最适反应p H为6.0,p H在3.0～10.0之间酶活稳定性较好,静置1 h后仍能保持75%以上的酶活。微量的Mn、Ca、Li对PG的酶活有少量的激活作用,Cu、Si、Fe对PG酶活有较强的抑制作用。

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶解朊金黄杆菌环保饲料开发诱变育种发酵工艺优化

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高产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的选育及特性分析

高产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的选育及特性分析

作者：朱锐华东师范大学

学位级别：硕士

植物蛋白来源于植物,主要包括大豆蛋白、谷蛋白等,与动物蛋白营养价值相仿,但植物蛋白不含胆固醇,具有多种生理保健功能,在保健食品、健康饮料等领域应用十分广泛,在追求大健康的时代,基于植物基的蛋白食品日益受到青睐。植物蛋白中谷... 详细信息

植物蛋白来源于植物,主要包括大豆蛋白、谷蛋白等,与动物蛋白营养价值相仿,但植物蛋白不含胆固醇,具有多种生理保健功能,在保健食品、健康饮料等领域应用十分广泛,在追求大健康的时代,基于植物基的蛋白食品日益受到青睐。植物蛋白中谷氨酰胺较多,这些酰胺基之间容易形成氢键等结构,从而使得蛋白质发生聚集、沉淀,使其溶解度较低,影响了其在植物蛋白饮料以及其他食品中的应用,因此,需要对植物蛋白的性能进行改性,增强其溶解性,提高其利用率,拓宽其在食品工程中的应用和市场。蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,简称PG酶)是一种新型的蛋白质改性剂,它可以作用于多种蛋白质、多肽侧链上的谷氨酰胺基团,发生脱酰胺作用,从而提高蛋白质的溶解性及其它特性,且不会产生交联反应,不会引起蛋白质风味的改变,改性条件温和,特异性高,应用广泛,具有很好的市场潜力。目前,对于PG酶产生菌株的研究较少,PG酶主要来源于解朊金黄杆菌Chryseobacterium proteolyticum,野生菌株发酵产PG酶的能力较差,限制了PG酶的工业化生产和广泛应用。本研究旨在筛选出高产PG酶的野生菌株,不同菌株产生的PG酶性质有差异,对植物蛋白的脱酰胺程度不一样,因此需要挖掘更多的新型产PG酶菌株,并进行鉴定,同时分析不同菌株的PG酶序列,利用原生质体-UV诱变筛选高产菌株、特性菌株,通过优化菌株的发酵条件,提高PG酶产量,为开展PG酶大规模生产和应用奠定基础。本课题主要研究内容如下:1.建立筛选产PG酶菌株的富集培养方法本研究根据菌株的生长特性,确定最优的PG酶生产菌株富集方案是:F富集培养基,10%接种量,培养5天。与现有文献报道的培养9天相比较,本研究的筛选方法富集时间缩短,筛选效率提高。对49份土壤悬液进行富集培养,筛选到72株产PG酶的菌株,其中16株菌株的酶活大于2.0U/m L,文献报道的产PG酶野生菌株的酶活为0.26-0.72U/m L,菌株A4142的酶活为2.15U/m L,是文献报道的最高酶活野生菌株ZYF 120413-7的2.99倍,为生产提供优良菌株。2.鉴定产PG酶的菌株对46株产PG酶的菌株进行鉴定,A4142等42个菌株属于Chryseobacterium proteolyticum,THN1是Chryseobacterium oranimense,T9541是Chryseobacterium sediminis,T15113是Chryseobacterium gleum,4A1是Chryseobacterium cucumeris,共计筛选到5个不同菌种的菌株,酶活在0.38～2.15U/m L。其中,*** THN1、*** T9541、*** 4A1这3种产PG酶的菌株为本文首次报道,扩大PG酶的菌株来源,丰富了菌种库。***酶鉴定和分析菌株发酵液的SDS-PAGE电泳均能观察到在18.4KD上边有一条条带,与文献报道的PG酶理论分子量19860相一致。通过测定并分析菌株的PG酶序列,结果表明A4142等42株***与日本文献报道的***9670T的PG酶蛋白序列相似度为100%,THN1、T9541、T15113、4A1和*** 9670T的PG酶蛋白序列相似度为74%以上,可见不同种菌株产生的PG酶序列存在差异,来源于不同菌种的PG酶性质可能不同,对植物蛋白的脱酰胺程度不一样,进而拓展PG酶在食品工业领域的应用。通过分析菌株的产酶曲线,确定其快速产酶期、酶活最高点,便于更好地指导菌株在实践中的应用。4.原生质体-UV诱变育种优化制备原生质体的条件,确定最佳条件为:菌浓度为OD=5,25mg/m L溶菌酶,30℃酶解1.5h,加入100μL 0.1%SDS,此时,原生质体的形成率、纯度、再生率这三者乘积为75.94%,相比较实验室前期建立的原生质体制备方法,效率提高了45.76%。根据致死率、正突变率,确定UV照射时间为30s。优化酶促反应的底物浓度,酶活增加到3.04U/m L,提高了32.17%。经过三轮诱变筛选,共计初筛6351菌株,得到菌株PU0316,酶活为3.73U/m L,提高15.48%。本研究筛选到可以正常分泌PG酶的白色解朊金黄杆菌,便于后期PG酶的发酵纯化,丰富了菌株类型。5.菌株发酵条件的优化通过单因素优化,确定乳糖为最佳碳源,多聚蛋白胨为最佳氮源,促进剂可以稳定培养基的p H、铵离子保持较低水平,司盘80对菌株生长有促进作用,通过优化发酵条件,确定菌株最优产酶的培养条件是:0.1%乳糖、2.0%多聚蛋白胨、1.5%促进剂、240r/min转速,此时,菌株的产酶最高,酶活为

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶菌株筛选菌株鉴定培养基优化解朊金黄杆菌

蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的诱变育种发酵优化及酶对谷朊粉的改性

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蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的诱变育种发酵优化及酶对谷朊粉的改性

作者：黄大亭华东师范大学

学位级别：硕士

蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG酶）作为一种新型的蛋白质脱酰胺酶,由解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）产生。它可以把蛋白质或多肽侧链上的谷氨酰胺转化成谷氨酸,在蛋白质的改性研究中得到广泛应用。目前野... 详细信息

蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG酶）作为一种新型的蛋白质脱酰胺酶,由解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）产生。它可以把蛋白质或多肽侧链上的谷氨酰胺转化成谷氨酸,在蛋白质的改性研究中得到广泛应用。目前野生菌株PG酶的酶活较低,距工业化生产的目标较远。本研究旨在通过NTG诱变筛选得到一株PG酶高产菌株,并对菌株进行发酵工艺优化和发酵罐放大培养,为PG酶工业化生产奠定基础。谷朊粉是一种物美价廉的天然植物蛋白,由于含有较多的谷氨酰胺导致溶解性较差,从而限制了其在食品中的应用。本研究优化了PG酶改性谷朊粉条件,探究改性后谷朊粉功能特性和结构的变化,并初步应用于鸡肉丸和谷朊粉蛋白饮料中。主要研究结论如下:（1）PG酶高产菌株的诱变育种以解朊金黄杆菌TM1040为出发菌株,以致死率为指标确定了NTG诱变的最佳条件,经过5轮递推式诱变,初筛6347株菌,复筛167株菌,最终得到一株高产菌株T37,酶活为5.07±0.03 U/m L,与出发菌株相比提高了45.46%。高产菌株T37突变基因KEGG通路主要涉及嘌呤代谢、嘧啶代谢、氨基酸的生物合成等。（2）出发菌株TM1040和高产菌株T37三角瓶发酵优化菌株TM1040的最优发酵条件为:培养温度30℃,装液量25 m L/250 m L,转速200 r/min,接种量7%;利用单因素实验和CCD响应面实验设计优化得到最优发酵培养基成分为:α-乳糖5 g/L、多聚蛋白胨20 g/L、七水硫酸镁2.5 g/L,磷酸二氢钾4.89 g/L,十二水磷酸氢二钠0.43 g/L。优化后酶活为4.59 U/m L,较优化之前提高了43.43%。利用单因素实验和CCD响应面实验设计优化得到菌株T37最优发酵培养基成分为:酵母蛋白胨FP103 19.11 g/L,磷酸二氢钾4.89 g/L,十二水磷酸氢二钠0.43 g/L,七水硫酸镁2.07 g/L,七水硫酸亚铁0.07 g/L,PEG2000 4.53 g/L。优化后酶活为5.24 U/m L,相较于优化之前提高了5.65%。（3）高产菌株发酵罐放大培养在10 L发酵罐中以Ka和混合时间为指标优化了搅拌桨组合,发现搅拌桨组合为六平叶+BT6+BT6时,具有较高的Ka和较短的混合时间。利用该搅拌桨组合对菌株TM1040在10 L发酵罐中进行放大培养,酶活在12 h达到最高值,为2.88±0.47 U/m L,较六平叶组合的酶活2.47±0.19 U/m L提高16.60%。将此条件运用于高产菌株T37的发酵,酶活在16h达到最高值为3.97±0.14 U/m L。（4）PG酶对谷朊粉的改性作用通过单因素实验和CCD响应面实验设计优化PG酶对谷朊粉的最优改性条件为:酶与底物比30 U/g,反应p H 7,反应温度为55℃,以此条件反应2 h,脱酰胺度为73.49%。不同脱酰胺度的谷朊粉在p H5～9范围内溶解性都显著提高,蛋白浓度为4 mg/m L条件下改性谷朊粉的乳化活性（EA）显著提高;改性后谷朊粉的起泡性和持水持油能力均优于对照。FTIR和CD对谷朊粉二级结构分析均表明改性后β-折叠比例增加、α-螺旋比例减少;改性后谷朊粉粒径显著降低,Zeta电位随着脱酰胺程度的增加逐渐增加。（5）改性谷朊粉在食品中的应用将脱酰胺度60%的谷朊粉以5%的添加量加入到鸡肉丸中,鸡肉丸硬度、凝聚性、胶着性、咀嚼性、回复性均增加。改性谷朊粉制备的蛋白饮料,卡拉胶浓度为0.015%即能较好地起到稳定的作用。改性谷朊粉浓度为9%,121℃灭菌15min后,常温下储存30天沉淀率仅为1.32%。综上所述,本文通过NTG诱变筛选到一株高产菌株T37,并初步探究了菌株的高产机理。接着对出发菌株TM1040的种子培养条件、发酵培养条件进行了优化,在此基础上对菌株T37的发酵培养条件进行了优化,并放大到10 L发酵罐中。最后对PG酶改性谷朊粉的条件进行了探究,系统研究了改性后谷朊粉理化特性和结构的改变并制备了高蛋白饮料。

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶解朊金黄杆菌 NTG诱变发酵优化谷朊粉改性

应用原生质体融合技术选育蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株

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应用原生质体融合技术选育蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株

作者：严文娟华东师范大学

学位级别：硕士

蛋白质谷氨酰胺酶能够直接催化大分子蛋白质脱酰胺,而不需要先对蛋白质进行水解,其脱酰胺过程也不会引起蛋白质结构的不良变化;且蛋白质谷氨酰胺酶的特异性高,只作用于蛋白质侧链的谷氨酰胺,而不能使天冬酰胺脱酰胺。通过蛋白质谷氨酰... 详细信息

蛋白质谷氨酰胺酶能够直接催化大分子蛋白质脱酰胺,而不需要先对蛋白质进行水解,其脱酰胺过程也不会引起蛋白质结构的不良变化;且蛋白质谷氨酰胺酶的特异性高,只作用于蛋白质侧链的谷氨酰胺,而不能使天冬酰胺脱酰胺。通过蛋白质谷氨酰胺酶的作用,蛋白质的二级结构中的利于蛋白质改变的柔性结构的成分增加,使得蛋白质的溶解度增加,进一步的也改善了蛋白质功能特性,如乳化性、起泡性等,由此扩大了蛋白质在食品工业中的应用。因此,蛋白质谷氨酰胺酶被称为最具有潜力的蛋白质改性工具。目前国内外对蛋白质谷氨酰胺酶的研究主要以其应用为主,对产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的报道较少。华东师范大学微生物实验室经过5年从中国九个不同省份土样中筛选得到45株产蛋白质谷氨酰胺酶菌株,其中33株解朊金黄杆菌为食品用安全菌株。但是这些从土壤样品中筛选到的野生型菌株发酵后的蛋白质谷氨酰胺酶产量较低,不能将这些菌株直接应用于工业生产,需要通过一定的方法对菌株进行诱变,以提高其蛋白质谷氨酰胺酶产量。本研究选取两株野生型菌株为亲本,利用原生质体融合技术进行多轮递推式融合,最终获得蛋白质谷氨酰胺酶高产融合菌株,主要研究结果如下:1.原生质体融合出发菌株的确定以33株解朊金黄杆菌野生菌株建立育种出发菌菌种库,利用全自动核糖体分型将33株解朊金黄杆菌分为三大类,将33株解朊金黄杆菌发酵测定其蛋白质谷氨酰胺酶酶活,结果表明,L11酶活最高,Y8在优化前后的培养基中的酶活表现最稳定。结合之前的全自动核糖体分型及土样来源分析,最终确定来自四川绵阳的分型为I类的Y8和来自上海青浦的分型为Ⅲ类的L11为原生质体融合的亲本。2.原生质体融合实验条件的确定本研究首次将原生质体融合技术应用于蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株的选育,经优化最终确定的实验条件为:将菌液稀释至OD600为2.00,加入0.1 mol/L EDTA和0.1%SDS至EDTA的终浓度为0.008 mol/L、SDS的终浓度为0.002%进行预处理,然后重悬至含有25 mg/mL Sigma溶菌酶的SMM Buffer中进行处理获得原生质体。得到两株亲本的原生质体悬液分别在距离15 W的紫外灯30 cm处灭活3 min和60℃水浴热灭活2 min,取等体积两种不同方式灭活的原生质体悬液混合后离心去上清,加入融合剂于20℃ 200 r/min振荡融合40 min。涂布再生培养基挑取并筛选长出的融合子。在此实验条件下,原生质体的形成率为91.19%±3.56%、再生率为66.53%±2.71%、纯度为85.87%±1.18%、融合率为1.52%±0.22%。3.四轮递推式原生质体融合选育高产菌株以野生菌株Y8和L11为亲本进行第四轮递推式原生质体融合,四轮共计通过48孔板初筛共计初筛11233株菌,经过48孔板、试管和摇瓶三种体系复筛,四轮高产菌株较该轮出发菌株酶活最高分别提高31.51%、19.12%、18.96%和21.32%。最终得到的1株高产菌株命名为PF-Y0448,该菌株经传代10次,其蛋白质谷氨酰胺酶酶活平均值为1.14±0.09 U/mL,较野生型菌株Y8和L1 1最高能提高143%～175%。4.高产菌株特性分析生长产酶曲线结果表明,L11和PF-Y0448的对数生长期为4h-12h,生长8h后开始产酶,L11在19 h时酶活最高,PF-Y0448产酶的最高点略早于L11,在发酵第16 h。两株菌在发酵第24 h时的单位菌体量酶活达到最大值。对高产菌株的碳源、氮源利用分析结果表明,在不同的碳源和氮源条件下,蛋白质谷氨酰胺酶酶活不同,其中以5 g/L的乳糖为碳源、15 g/L的多聚蛋白胨为氮源时酶活最高。在发酵培养基补加实验中发现,发酵培养基以0.3 g/L葡萄糖为碳源,当葡萄糖消耗完后添加5g/L的乳糖有助于提高蛋白质谷氨酰胺酶酶活。5.L11和PF-Y0448生物信息学分析为初步探究菌株蛋白质谷氨酰胺酶的高产机制,本研究利用第三代测序技术对L11进行全基因组测序,其中编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因位于ORF03588,根据Softberry启动子预测结果可知,ORF03588和ORF03589在同一操纵子,由同一启动子调控完成某项生物学功能,但是ORF03589的功能还不明确,需要进一步的探究。以L11为参考序列利用第二代测序技术对PF-Y0448进行重测序,筛选其SNP和InDel并进行功能注释,结果表明,PF-Y0448上的SNP主要被归类为碳水化合物运输与代谢、无机离子迁移和代谢、氨基酸转运和代谢、核苷酸苷酸代谢及酪氨酸代谢相关。PF-Y0448上InDel插入突变序列为假想蛋白,暂不能确定其功能。由于对测序结果的挖掘尚不够深入,无法将分析结果与蛋白质谷氨酰胺酶酶活进行关联,因此尚无法得出可能的高产原因。但本研究首次对该菌株进行全基

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶解朊金黄杆菌原生质体融合微生物育种生物信息学

蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的诱变育种及其对酪蛋白的改性研究

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蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的诱变育种及其对酪蛋白的改性研究

作者：黄灵灵华东师范大学

学位级别：硕士

蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG,EC 3.***.1.44）是一种新型的蛋白质脱酰胺酶。它能催化蛋白质或多肽中的谷氨酰胺残基脱酰胺成谷氨酸并释放氨,这会使蛋白质表面的负电荷增多,空间位阻降低,两亲性提高,可以改善食品蛋白的溶解... 详细信息

蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG,EC 3.***.1.44）是一种新型的蛋白质脱酰胺酶。它能催化蛋白质或多肽中的谷氨酰胺残基脱酰胺成谷氨酸并释放氨,这会使蛋白质表面的负电荷增多,空间位阻降低,两亲性提高,可以改善食品蛋白的溶解性、乳化性、发泡性等功能性质。目前,PG在多个国家被允许作为食品工业酶制剂使用,市场需求潜力巨大。日本Amano公司已经实现PG商业化,并垄断了技术和市场。国内还未实现PG的工业化生产。由于PG的生产菌株解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的产酶能力较低,没有合适的遗传操作工具,导致PG的生产成本高昂,限制了其在食品领域的应用。为打破PG的垄断,实现PG的工业化生产,本研究以解朊金黄杆菌P316作为出发菌株,采用亚硝基胍（NTG）诱变获得高产菌株,并进行发酵条件优化进一步提高酶活。对基因组框架图及突变位点进行分析,初步探究其高产机制。同时,利用PG对酪蛋白进行脱酰胺改性,研究脱酰胺后酪蛋白的二级结构及功能性质,并探究其在蛋白饮料中的应用。本研究的主要内容如下:1.诱变育种条件优化及高产菌株选育本研究以实验室诱变得到的解朊金黄杆菌P316为研究对象,基于致死率建立了NTG诱变方法,经过五轮递推式NTG诱变,一共初步筛选了7179个突变株。经过48深孔板初筛、摇瓶复筛、自然选育、稳定性验证,最终获得一株高产菌株20210514-P316107N-502（P502）,酶活为4.82±0.15 U/m L,与出发菌株相比提高了72%。2.高产菌株发酵条件优化及高产机制初步探究通过单因素优化了发酵培养基的碳源、氮源、无机盐和表面活性剂,进一步通过CCD响应面实验优化最佳培养基成分为:FP103 1.799%,Mg SO·7HO 0.2%,Fe SO·7HO 0.007%,PEG2000 0.379%,NaHPO 0.017%,KHPO 0.489%,发酵验证的酶活为5.02±0.14 U/m L,与优化前相比,酶活提高了4.1%。代谢曲线分析表明,高产菌株比出发菌株生长慢,但产酶快。对两株菌进行测序,获得其基因组框架图。进一步比对分析,共检测到高产菌株中119个SNP突变和1个移码插入的In Del突变。根据KEGG功能富集分析,与突变有关的最主要的通路是氨基酸的生物合成以及组氨酸代谢。moe A、thi S、pox B、met H、paa H、spe A、gly A、gln S等基因的突变可能是高产菌株酶活提高的原因。3.蛋白质谷氨酰胺酶对酪蛋白脱酰胺条件的优化通过单因素优化了酪蛋白浓度、p H、酶与底物比、温度等脱酰胺条件,并采用CCD响应面法优化PG脱酰胺的最适条件为:酪蛋白浓度1%,p H 6.0,酶与底物比（E/S）15 U/g,温度45℃。在此条件下,反应1 h后,脱酰胺度为29.14%,此后脱酰胺度缓慢增加,直到4 h后基本保持不变。以优化的条件进行脱酰胺反应2 min、10 min和1 h后,得到脱酰胺酪蛋白样品,脱酰胺度分别为15.02%、26.88%和32.33%,水解度分别为3.49%、3.57%和3.80%。4.蛋白质谷氨酰胺酶改性酪蛋白的性质研究圆二色谱结果表明,脱酰胺酪蛋白中α-螺旋结构比例减少,β-折叠结构比例增加。在p H 8.0的条件下,脱酰胺酪蛋白样品的乳化活性均高于对照样品。在p H为5.0～6.0时,脱酰胺酪蛋白的溶解性明显增加。随脱酰胺度的增加,酪蛋白的发泡性及持水持油能力增强,且Zeta电位增加、粒径减小,增强了酪蛋白溶液的稳定性。用3%酪蛋白制备饮料,经过121℃、15 min高温灭菌处理后,脱酰胺酪蛋白的沉淀率都低于对照,在添加0.05%卡拉胶的蛋白饮料中,脱酰胺酪蛋白饮料的贮存稳定性也高于对照。综上所述,本研究通过NTG诱变育种得到PG高产菌株P502,优化了PG改性酪蛋白的条件,研究了脱酰胺酪蛋白的结构变化和功能性质,并应用于中性酪蛋白饮料中。拓宽了PG在食品行业中的应用范围,为实现PG的工业化奠定了基础。

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶解朊金黄杆菌 NTG诱变发酵条件优化脱酰胺酪蛋白

蛋白质谷氨酰胺酶菌株选育及酶解大豆蛋白的应用研究

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蛋白质谷氨酰胺酶菌株选育及酶解大豆蛋白的应用研究

作者：苗杏南京农业大学

学位级别：硕士

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein Glutaminase,简称PGase或PG)是一类能够水解蛋白质及多肽侧链上谷氨酰胺残基的水解酶,不催化游离的谷氨酰胺和侧链天冬酰胺残基,底物特异性强。其脱酰胺作用可显著改善植物蛋白功能性质(溶解性、凝胶化、乳化... 详细信息

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein Glutaminase,简称PGase或PG)是一类能够水解蛋白质及多肽侧链上谷氨酰胺残基的水解酶,不催化游离的谷氨酰胺和侧链天冬酰胺残基,底物特异性强。其脱酰胺作用可显著改善植物蛋白功能性质(溶解性、凝胶化、乳化性、起泡性等),从而提高植物蛋白加工特性。现已有许多研究成功将PG应用于蛋白质的改性,例如大豆蛋白、椰蛋白、小麦面筋、大米蛋白、豌豆蛋白等。PG目前主要以微生物发酵获得为主,而目前国内研究PG高产菌株较少,缺乏高产蛋白质谷氨酰胺酶的自有知识产权菌种,亟待通过人工诱变选育高产PG菌种,满足工业化要求。为获得高产菌株,本文利用紫外(UV)诱变和常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对实验室保存的解阮金黄杆菌1003进行诱变,对高产突变株和出发菌株进行了酶学性质研究。并研究突变株PG酶液对大豆分离蛋白(SPI)脱酰胺度及功能性质的影响。主要研究结果如下:1.蛋白质谷氨酰胺酶菌株诱变育种以解阮金黄杆菌1003为研究对象,探索紫外诱变和ARTP诱变最佳处理时间。固定紫外诱变参数:处理功率11 w,置于紫外灯下30 cm,当诱变时间30 s时,菌株致死率为88%,正突变率12%左右,此时诱变效果最好;固定ARTP诱变参数:处理功率125 W,诱变气流量10 splm,置于离子源下2 mm,当诱变时间30 s时,致死率为81%,正突变率13%左右,此时诱变效果最好。本文使用96深孔板初筛、摇瓶复筛,以酶活/OD作为筛选指标,最后从3288株突变株中筛选出一株能够稳定遗传、酶活提高20%的突变株UUA-3D8,酶活可达到2.16 U/m L。2.蛋白质谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白功能特性的影响突变株UUA-3D8经发酵、离心获上清液、乙醇沉淀、超滤后获得PG酶液,纯化后的PG酶液加入到1%的SPI中,使制备的100 m L SPI溶液酶活分别为0 U、0.5 U、10 U、100 U。37°C,130 rpm酶解1 h后,脱酰胺化SPI经过透析、冷冻干燥后储存在干燥器内。测定不同PG添加量对SPI功能性质的影响,结果表明随着PG添加量的增加,SPI脱酰胺效果越显著。当PG添加量为100 U时,SPI脱酰胺度为22%,SPI聚集体明显变少,溶解度从21.5%提高到58%,但热稳定性稍有降低;当PG添加量为10 U时,脱酰胺后的SPI功能性质得到显著改善,乳化活性为26.97 m/g,比未脱酰胺SPI提高了85.62%;乳化稳定性提高了53.21%;起泡稳定性由未脱酰胺SPI22.83%提高到25.60%。当PG添加量为0.5 U时起泡性由未脱酰胺SPI 34.60%提高到46.13%。本研究利用紫外诱变、ARTP诱变成功建立了蛋白质谷氨酰胺酶的突变文库,最后筛选出一株酶活稳定提高20%的突变型酶,并用其改性SPI。这一研究有利于提高工业化菌株酶活及其为改善SPI加工特性提供一定参考。

关键词：蛋白质谷氨酰胺酶解朊金黄杆菌诱变育种大豆分离蛋白