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嗜热菌ToPif1解旋酶与G四链体的互作活性位点预测及鉴定

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陕西师范大学学报（自然科学版） 2022年第5期50卷 99-107页

作者：张玲玲戴阳雪奚绪光西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

利用AlphaFold2人工智能程序在原子水平预测并验证嗜热菌Themus oshimai Pif1(ToPif1)解旋酶参与特殊核酸二级结构G四链体(G4)解旋的关键活性位点。采用变温圆二色光谱测试及解旋实验确定ToPif1解旋酶的嗜热特性;利用AlphaFold2程序预测... 详细信息

利用AlphaFold2人工智能程序在原子水平预测并验证嗜热菌Themus oshimai Pif1(ToPif1)解旋酶参与特殊核酸二级结构G四链体(G4)解旋的关键活性位点。采用变温圆二色光谱测试及解旋实验确定ToPif1解旋酶的嗜热特性;利用AlphaFold2程序预测ToPif1与G4 DNA的互作氨基酸位点,并应用分子生物学工具将预测互作位点分别突变为丙氨酸;通过原核表达系统获得ToPif1的单点突变体蛋白,突变体蛋白经ATP水解实验验证后发现其基本活性不受损;通过荧光各向异性实验和荧光共振能量转移偶联快速停留技术对比ToPif1野生型和突变体对不同构型G4 DNA的结合活性及解旋活性差异,确认影响ToPif1结合和解旋G4的关键氨基酸位点。结果表明:ToPif1解旋酶在高温下仍可保持蛋白构象及解旋活力;预测结果显示ToPif1上存在8个与G4互作的潜在位点,且这些位点的单点突变均不会破坏ToPif1的ATP水解活力;在ToPif1结合G4^(CEB)和G4^(Tel)中发挥关键作用的氨基酸位点是R355,而显著影响ToPif1解旋G4活力的位点是R135和R355。研究结果明确了具有嗜热特性的ToPif1发挥结合、解旋G4 DNA活性的关键氨基酸位点,为理解嗜热菌Pif1解旋酶识别与解旋G4 DNA的机理提供了参考。

关键词：解旋酶活性位点 AlphaFold2结构预测 G四链体 Pif1家族

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G四链体互作蛋白及其研究方法进展

科学通报 2023年第30期68卷 3887-3898页

作者：黄海燕周翔武汉大学化学与分子科学学院武汉430072

G四链体是一种非经典的核酸二级结构,并且已经被证实大量存在于多种生物基因组及转录组中的关键调节位点.由于其特殊的四链结构,G四链体能够与多种功能的蛋白发生相互作用,从而参与生物体多种生理及病理过程的调控.因此,G四链体互作蛋... 详细信息

G四链体是一种非经典的核酸二级结构,并且已经被证实大量存在于多种生物基因组及转录组中的关键调节位点.由于其特殊的四链结构,G四链体能够与多种功能的蛋白发生相互作用,从而参与生物体多种生理及病理过程的调控.因此,G四链体互作蛋白的结构及功能研究将有利于进一步揭示G四链体的生命活动调节机制,促进开发G四链体及其互作蛋白作为疾病治疗靶点的新型治疗方法.近年来,得益于核酸-蛋白互作研究方法的进步及G四链体互作蛋白研究新技术的开发,科学家已经发现了多种功能各异的G四链体互作蛋白.本文简要介绍了已知G四链体互作蛋白的种类和功能,综合评述近年来G四链体互作蛋白研究方法的发展,并对未来的发展方向进行展望.

关键词： G四链体 G四链体互作蛋白解旋酶复制转录端粒

SARS-CoV-2解旋酶NSP13 stalk结构域在解链中的作用机制研究

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SARS-CoV-2解旋酶NSP13 stalk结构域在解链中的作用机制研究

作者：岳坤北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒,其导致的新型冠状病毒肺炎由于高传染性导致了全球疫情爆发。截止目前,病毒变异株仍威胁着人类健康和生活乃至社会经济发展。新型冠状病毒非结构蛋白NSP13是一种进化高度保守的解旋酶,负责打开双... 详细信息

目的:SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒,其导致的新型冠状病毒肺炎由于高传染性导致了全球疫情爆发。截止目前,病毒变异株仍威胁着人类健康和生活乃至社会经济发展。新型冠状病毒非结构蛋白NSP13是一种进化高度保守的解旋酶,负责打开双链核酸底物,在病毒复制过程中有着至关重要的作用。所以NSP13被研究人员认为是一个极具潜力的抗病毒靶标。NSP13的N端为锌结合结构域(Zinc-binding domain,ZBD),C 端为解旋酶区域(helicase),两者由 stalk 结构域连接。尽管目前其蛋白质晶体结构已被解析,但NSP13的stalk结构域在解旋酶中发挥作用的机制尚不清楚。我们旨在阐明stalk结构域是如何参与NSP13发挥解旋酶功能的这一科学问题。方法:NSP13是一种ATP酶活性依赖的解旋酶。首先,利用ATP酶活性检测试剂盒通过孔雀石绿定磷法对其ATP酶活性进行检测。我们建立了一个基于荧光共振能量转移原理的体外双链RNA解链系统,通过实时动力学研究NSP13的解旋酶活性。利用RNA pulldown的实验技术比较了 NSP13野生型及其突变体蛋白的核酸结合情况。在蛋白质的稳定性上,利用热漂移实验对NSP13野生型蛋白以及突变体蛋白进行蛋白质热稳定性的检测。结果:在建立NSP13解链系统后,我们对NSP13的基本性质进行了探究。我们发现,当缺失stalk结构域时,NSP13由于ATPase酶活性的丧失而失去了其解链活性,这证明了 stalk结构域对NSP13解旋酶活性的必要性。随后,为了探讨stalk结构域的柔性或刚性连接对解旋酶活性的影响,我们在ZBD和stalk或stalk和 helicase 之间插入了一个短的柔性 linker(Z-linker-SH 和 ZS-linker-H)。首先,linker插入突变体(Z-linker-SH和ZS-linker-H)均不影响ATPase酶活性。有趣的是,只有当linker插入stalk和helicase之间(ZS-linker-H)时,NSP13才会失去解链活性;而linker插入ZBD和stalk之间(Z-linker-SH)时,对解链活性并没有影响。其分子机制是ZS-linker-H突变体影响了核酸结合。并且,ZS-linker-H的蛋白质的热稳定性明显降低。结论:我们的研究结果证明了 stalk结构域对NSP13发挥解旋酶功能至关重要,并且stalk结构域介导的与helicase之间的刚性连接很重要。这项工作解释了 NSP13 stalk结构域介导的解链活性的分子机制,有助于阐明NSP13在病毒复制过程中发挥解旋酶功能的具体运作机制以及为新型冠状病毒的药物设计和疫苗研发提供思路。

关键词：新型冠状病毒 NSP13 解旋酶 stalk结构域解链

猪肺炎支原体解旋酶RuvA、RuvB的原核表达及生化活性鉴定

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猪肺炎支原体解旋酶RuvA、RuvB的原核表达及生化活性鉴定

作者：邢蕙萱西藏农牧学院

学位级别：硕士

猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引发的一种慢性肺炎,又称猪地方流行性肺炎。长期以来,该病一直被认为是养猪业最常发生、流行最广且最难净化的重要疫病之一。Mhp感染在世界范围内高度流行,由于治疗和... 详细信息

猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引发的一种慢性肺炎,又称猪地方流行性肺炎。长期以来,该病一直被认为是养猪业最常发生、流行最广且最难净化的重要疫病之一。Mhp感染在世界范围内高度流行,由于治疗和疫苗接种的费用增多、生猪品质下降和继发感染导致的死亡率增加等给养猪业造成了巨大的经济损失。Mhp还能够与猪肺炎分枝杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌以及其他细菌,如支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌等混合感染,诱发猪呼吸道综合征。目前治疗和预防包括猪支原体肺炎在内的支原体疾病的主要方法是使用抗生素和疫苗。这些方法可以减轻疾病的有害影响、降低发病率,但治疗后宿主体内仍能检测到支原体,容易导致复发和持续性感染。因此,探索有效的药物靶标,开发抗Mhp的药物对猪支原体肺炎防治具有重要意义,也可为其它抗支原体药物的开发提供借鉴。普遍认为,病原微生物逃避宿主免疫检测和控制的最常见策略是抗原变异。而通过分布在支原体基因组中的特定重复DNA元件（VNTRs）之间的同源重组是其抗原变异的重要途径之一。解旋酶RuvAB是参与同源重组的重要酶类,但在支原体中的相关机制尚不明确。因此,解析RuvAB的生化活性将为进一步深入探索RuvAB参与支原体重组修复的分子机制提供基础,进而辅助以它们为靶点的药物研发。本研究首先通过q PCR、普通PCR鉴定RuvAB与抗原变异的关系,初步确定RuvA和RuvB可能影响猪肺炎支原体的抗原变异。再借助原核表达系统诱导表达RuvAB蛋白,利用新西兰大白兔制备多克隆抗体,为后续实验提供生物学材料及实验基础。最后设计不同DNA结构模板底物,利用凝胶迁移实验（EMSA）分析二者的底物特异性、DNA结合能力,利用表面等离子共振技术（SPR）解析RuvAB的底物亲和力。本研究具体内容如下:1、基于蛋白质多序列比对鉴定了RuvA、RuvB和其它几种致病支原体的同源性,发现RuvA和RuvB的保守性较高,表明其可能与其它已报道的支原体一样,影响M.hyopneumoniae的抗原变异。分别从菌株间和菌株内分析了M.hyopneumoniae抗原基因序列变异和RuvA、RuvB转录水平差异的相关性。结果发现,VNTRs重复次数更多的分离株RuvA和RuvB转录水平更高;经DNA损伤剂处理后的M.hyopneumoniae,其抗原基因H4的VNTR出现了长度变异,并且RuvA和RuvB呈现转录水平上调。以上结果提示,猪肺炎支原体抗原序列变异与RuvAB表达具有相关性。2、利用将目的蛋白基因与双酶切质粒连接,构建pET21a-RuvA、pGEX-4T-1-RuvB重组质粒。借助E.coli HB101菌株诱导表达RuvAB蛋白,利用镍亲和层析住和谷胱甘肽亲和层析柱纯化,获得高纯度目的蛋白。3、利用新西兰大白兔制备RuvA多克隆抗体,借助ELISA和Western blot技术检测抗体效价及免疫原性。获得了效价达1:156000以上且特异性强的RuvA多克隆抗体。4、利用表面等离子共振技术（SPR）结合凝胶迁移实验（EMSA）分析RuvA和RuvB的DNA结合活性,发现RuvA可以与单链、双链DNA底物结合,形成复合物;RuvA对含有单链尾巴的双链DNA底物（复制叉模拟结构）的结合能力更强,且3’-overhang的结合能力高于5’-overhang;底物链越长,RuvA的结合能力越强;添加Mg对RuvA的结合能力有抑制作用;RuvA对RuvB有招募作用,但RuvB对RuvA不起招募作用;RuvA与ss DNA以八聚体形式结合。综上所述,本研究聚焦于RuvAB蛋白,鉴定了RuvAB蛋白与抗原变异的相关性,首次报道了RuvAB蛋白的质粒构建、表达、纯化过程,以及RuvA蛋白兔多抗的制备过程,检测分析了RuvAB蛋白在体外条件下与DNA底物的结合活性。为后续探索RuvAB调解同源重组介导Mhp抗原变异的分子机制奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体解旋酶原核表达底物结合活性

解旋酶DDX41在人牙髓组织及牙髓细胞中的表达

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南方医科大学学报 2015年第4期35卷 587-590页

作者：杨小军侯晋李心竹胡娇南方医科大学南方医院口腔科广东广州510515 南方医科大学口腔医学院广东广州510515

目的研究解旋酶DDX41在人牙髓组织和细胞中的表达,为深入探讨其在龋病及牙髓病天然免疫应答过程中的作用奠定基础。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术对人牙髓组织和牙髓细胞中DDX41的表达和定位进... 详细信息

目的研究解旋酶DDX41在人牙髓组织和细胞中的表达,为深入探讨其在龋病及牙髓病天然免疫应答过程中的作用奠定基础。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术对人牙髓组织和牙髓细胞中DDX41的表达和定位进行分析。结果 RT-PCR结果显示DDX41 m RNA在人牙髓细胞中有显著表达;免疫细胞化学和免疫组织化学染色结果显示DDX41在牙髓细胞的胞浆和胞核中皆有表达,但胞核中的表达水平较低;在牙髓组织中,DDX41主要在牙髓组织表面的成牙本质细胞的胞浆和胞核中皆有表达。结论人牙髓组织中的成牙本质细胞作为牙髓免疫的效应细胞之一,在龋病和牙髓炎的免疫反应过程中,细胞内可能存在DDX41/STING依赖的TBK1-IRF3-IFN-β信号通路的活化。

关键词：解旋酶 DDX41 牙髓组织 Ⅰ型干扰素天然免疫反应

全内反射瞬逝场照明高精度磁镊及其在DNA解旋酶研究中的应用

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物理学报 2013年第16期62卷 465-472页

作者：王爽郑海子赵振业陆越徐春华中国科学院物理研究所软物质物理重点实验室北京凝聚态物理国家实验室北京100190

传统磁镊的测量精度受限于磁球的布朗涨落,当磁力小于约10pN时,磁球的布朗涨落明显增大,对应磁镊的空间分辨率显著下降.为了提高传统磁镊在小力条件下的测量精度,本文将全内反射荧光技术引入到磁镊技术中,并建立相适应的"磁球-手柄-荧... 详细信息

传统磁镊的测量精度受限于磁球的布朗涨落,当磁力小于约10pN时,磁球的布朗涨落明显增大,对应磁镊的空间分辨率显著下降.为了提高传统磁镊在小力条件下的测量精度,本文将全内反射荧光技术引入到磁镊技术中,并建立相适应的"磁球-手柄-荧光微球-待测生物分子"单分子连接系统,在小力条件下(小于10pN)获得纳米量级的测量精度.应用改进的磁镊对DNA发卡的折叠-去折叠态的转变过程进行了研究,依据DNA发卡的折叠-去折叠态转变的性质对全内反射场的穿透深度进行了校正,并结合实验结果对改进后的磁镊的测量精度进行分析.观察了Bloom解旋酶的解旋动力学过程,获得初步实验结果,证实了改进的磁镊在单分子研究中的实用性.

关键词：磁镊全内反射荧光 DNA发卡解旋酶

Pif1维持基因组稳定性在肿瘤中发挥的作用

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中国医科大学学报 2022年第4期51卷 361-364页

作者：陈波李志杰中国医科大学附属盛京医院医学研究中心辽宁省环境与代谢疾病动物模型研究与应用重点实验室沈阳110004

解旋酶是核酸代谢所必需的酶,普遍存在于生物体内。Pif1是5’-3’方向ATP依赖的超家族ⅠB类解旋酶,几乎存在于所有真核生物中。Pif1不同程度地影响端粒、线粒体DNA的复制和冈崎片段的成熟。此外,Pif1可通过破坏稳定的核蛋白复合物来影... 详细信息

解旋酶是核酸代谢所必需的酶,普遍存在于生物体内。Pif1是5’-3’方向ATP依赖的超家族ⅠB类解旋酶,几乎存在于所有真核生物中。Pif1不同程度地影响端粒、线粒体DNA的复制和冈崎片段的成熟。此外,Pif1可通过破坏稳定的核蛋白复合物来影响这些过程。基于Pif1对维持基因组稳定性的重要性,为肿瘤相关疾病提供新的潜在治疗方向。本文论述了Pif1维持基因组稳定性在肿瘤中所发挥的作用。

关键词： Pif1 解旋酶基因组稳定性复制肿瘤

RECQ5β解旋酶DNA退火特性的动力学研究

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科学通报 2012年第8期57卷 618-625页

作者：丁秀艳徐雅楠李伟王鹏业奚绪光窦硕星西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100 中国科学院物理研究所软物质物理实验室北京凝聚态物理国家实验室北京100190 Institut Curie-Section de Recherche Centre UniversitaireBatiment 110F-91405 OrsayFrance

RecQ家族解旋酶对维持基因组完整性起着关键作用.许多RecQ家族解旋酶不仅可以打开双链及其他更复杂的DNA结构,而且有意思的是,还具有DNA退火活性.本文通过对DNA退火动力学、平衡态下DNA结合以及与单链DNA解离动力学的一系列测量,系统研... 详细信息

RecQ家族解旋酶对维持基因组完整性起着关键作用.许多RecQ家族解旋酶不仅可以打开双链及其他更复杂的DNA结构,而且有意思的是,还具有DNA退火活性.本文通过对DNA退火动力学、平衡态下DNA结合以及与单链DNA解离动力学的一系列测量,系统研究了RECQ5β的DNA退火特性.结果显示,在本研究的反应缓冲液条件下,在没有或存在不同的磷酸核苷因子（AMPPNP,ATPS或ADP）的情况下,当酶分子覆盖约40%~50%DNA单链时,RECQ5β催化的DNA退火效率最高.通过对RECQ5β1~662的比较研究证实,RECQ5β的C末端区域对该酶高的DNA退火活性是必不可少的.本文结果将有助于更好地理解RecQ家族解旋酶催化DNA退火的机理.

关键词：解旋酶 RECQ5β DNA退火动力学 DNA结合

上海科研团队在单分子水平揭示解旋酶与DNA互作新模式 006

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上海科研团队在单分子水平揭示解旋酶与DNA互作新模式