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慢病毒载体介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞和基质细胞的实验研究

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眼科新进展 2015年第12期35卷 1101-1104页

作者：梁伟怡白浪刘晶苏亚茹于健刘琼杨娟南方医科大学南方医院眼科广东省广州市510515

目的观察慢病毒载体(lentiviral vector,LV)介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞(corneal epithelial cell,CEC)和基质细胞(corneal stromal cell,CSC)的有效性和安全性。方法分别培养大鼠CEC和CSC,转染组用携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和TLR2小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)的LV转染,空白对照组加入空白培养液,阴性对照组加入不携带目的基因的LV。转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为10、50、100、200加入LV-TLR2-siRNA-eGFP,选择eGFP表达最强的MOI进行后续实验,观察细胞形态,CCK8检测细胞增殖情况。流式细胞仪检测两种角膜细胞的转染效率,RT-PCR检测转染后TLR2 mRNA的表达情况。结果 MOI=200时转染CEC和CSC荧光表达最高,和空白对照组相比细胞形态未发生明显改变;CCK8结果显示转染组与空白对照组、阴性对照组的IOD值差异均无统计学意义(均为P>0.05);流式细胞仪检测CEC和CSC转染效率分别为77.600% ±1.100%和76.300% ±1.387%,和阴性对照组相比差异均有显著统计学意义(均为P细胞安全性无影响,可有效下调TLR2 mRNA的表达。

关键词：慢病毒载体基因转染角膜细胞 TLR2

人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第50期14卷 9361-9365页

作者：葛红岩石妍杨帆张毅刘平刘含若哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院黑龙江省哈尔滨市150001 LUniversity of East Anglia Norwich NR4 England

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响。目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的... 详细信息

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响。目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用。方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过KpnI和SalI插入到原核表达载体pET32a(+)中。经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析;以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响。结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中。通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Westernblot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力。MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移。成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性。

关键词： BIGH3基因角膜细胞黏附迁移组织构建

准分子激光角膜切削术与磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

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准分子激光角膜切削术与磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

作者：盛艳浙江大学

学位级别：硕士

角膜的损伤愈合反应对角膜手术是至关重要的。对于准分子激光角膜切削术(PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)等角膜屈光手术而言,角膜损伤愈合反应是过矫、欠矫、角膜基质混浊和其它并发症的主要因素,因此角膜损伤愈合反应会直接影... 详细信息

角膜的损伤愈合反应对角膜手术是至关重要的。对于准分子激光角膜切削术(PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)等角膜屈光手术而言,角膜损伤愈合反应是过矫、欠矫、角膜基质混浊和其它并发症的主要因素,因此角膜损伤愈合反应会直接影响手术的安全性与预测性。近十年来,对屈光性角膜手术后角膜的损伤愈合反应成为很多眼科医生关心和研

关键词：凋亡角膜细胞角膜基质准分子激光角膜切削术准分子激光原位角膜磨镶术 TUNEL

准分子激光原位角膜磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的实验研究

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准分子激光原位角膜磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的实验研究

作者：陆勤康浙江大学

学位级别：硕士

角膜的损伤愈合反应对角膜手术是至关重要的。对于准分子激光角膜切削术(PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)等角膜屈光手术而言,角膜损伤愈合反应是过矫、欠矫、角膜基质混浊和其它并发症的主要因素,因此角膜损伤愈合反应会直接影响手术的安全性与预测性。浙江大学医学院眼科学硕士学位论文-一论文摘要2005年2月近十年来,对屈光性角膜手术后角膜的损伤愈合反应成为很多眼科医生关心和研究的科题。1996年Wilson等首次报道角膜上皮损伤后会出现浅层角膜基质细胞的消失是由细胞凋亡介导的;细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,它不同于细胞坏死,发生凋亡的细胞不释放淋巴因子和其它细胞内成分,因此不会引起周围组织、细胞的炎症反应。细胞凋亡在维持正常组织器官的稳定平衡及病理状态组织器官的损伤、修复中起着重要作用。后来的一些研究认为角膜上皮损伤后释放出的IL一1、Fas一L、BMP一2、BMP一4、TNF一a等细胞因子介导了角膜基质细胞凋亡的发生。并且早期角膜基质细胞凋亡的数量与后期基质细胞的激活增殖密切相关;与角膜愈合反应程度成正相关。我们最常用于观察角膜细胞发生凋亡的方法是透射电镜和脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标法(terminal一deoxynueleotidyl transferase mediateddUTP nick endlabeling,TUNEL)。用电镜观察可以在术后几分钟内发现角膜细胞出现凋亡的形态变化,而用脱氧核糖核营酸末端转移酶介导的缺口末端标法可以最早在术后10一30分钟内发现凋亡细胞,有研究发现在鼠或兔角膜上进行屈光手术后4小时是角膜基质细胞凋亡最多的时间。角膜细胞发生凋亡是上皮损伤后角膜基质最早可以观察到的基质变化。继角膜细胞发生凋亡后,其它的角膜细胞有丝分裂和移行,部分角膜细胞转化为肌纤维母细胞。这一复杂的细胞反应使得角膜基质重塑并引起上皮细胞的增殖。目前,准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)已成为屈光手术比较先进的方法之一,但尽管如此LASIK的手术效果受多种因素的影响,角膜愈合反应仍是重要因素之一。本研究旨在通过在兔眼上了建立不同的手术模型,在术后早期观察角膜基质细胞凋亡的发生,并对角膜基质凋亡细胞进行定量比较,来进一步阐明LAsIK术后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探索与LASIK术后角膜愈合反应程度及其与角膜刀的机械损伤、激光能量的相关性。浙江大学医学院眼科学硕士学位论文-一论文摘要2005年2月【研究目的】研究准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LAsxK)后早期角膜基质细胞凋亡的特点。通过在健康无眼疾的新西兰纯种白兔眼上建立不同矫正度数的LAsIK模型及单纯角膜瓣模型并设立空白对照组,在术后4小时这个峰值的时间点取角膜制作标本,观察角膜细胞凋亡的形态并计数,对比凋亡水平;进一步探索LAsIK术后角膜愈合反应程度与角膜刀的机械损伤、激光能量的相关性。【研究方法】健康无眼疾的新西兰纯种白兔20只,清洁级,体重3.5～4kg,雌雄兼有,饲养1周以上。新西兰纯种白兔随机分为两大组,其中10只兔子左眼为一*** LAsIK模型组、右眼为一***模型组、另10只兔子左眼为单纯角膜瓣模型组、右眼作为空白对照组。为便于实验结果进行统计分析,根据不同的实验模型分为四组:A组(单纯角膜瓣组,n二10眼),B组(LASIK一4.00组,n=10眼),C组(LASIK一8.00组,n=10眼),D组(空白对照组,n=10)。3Og/L戊巴比妥耳背静脉麻醉(lml/kg)动物后,用0.4%盐酸奥布卡因眼液(日本参天公司)行表面麻醉1一2次,实验动物置于手术台上,无菌生理盐水冲洗结膜囊。用

关键词：凋亡角膜细胞角膜基质准分子激光原位角膜磨镶术 TUNEL

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组织工程角膜种子细胞的研究进展

眼科新进展 2007年第7期27卷 538-541页

作者：林旭明赵靖史伟云山东省眼科研究所山东省青岛市266071

随着细胞培养及组织工程技术的发展,组织工程角膜种子细胞方面的研究获得一定进展,主要是探讨维持角膜种子细胞的活性及正常形态和性质的方法,并通过适当的载体进行移植,研究重建与正常角膜具有相同的形态结构及生理功能的组织工程角膜... 详细信息

随着细胞培养及组织工程技术的发展,组织工程角膜种子细胞方面的研究获得一定进展,主要是探讨维持角膜种子细胞的活性及正常形态和性质的方法,并通过适当的载体进行移植,研究重建与正常角膜具有相同的形态结构及生理功能的组织工程角膜,并最终应用于临床。本文就组织工程角膜种子细胞方面的进展做一综述。

关键词：组织工程角膜细胞移植

急性排斥期大鼠角膜移植物基质细胞凋亡的研究

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眼科新进展 2004年第2期24卷 97-99页

作者：周瑾陆晓和张永强贺玲第一军医大学珠江医院眼科广东广州510282 解放军第371医院眼科河南新乡453000

目的　研究急性排斥期角膜移植物基质细胞凋亡发生的规律 ,分析基质细胞凋亡与急性免疫排斥反应的关系。方法　建立大鼠穿透性角膜移植动物模型。实验分组 :A组 ,同种异体角膜移植组 ,Wistar→SD ;B组 ,同基因角膜移植组 ,Wistar→Wista... 详细信息

目的　研究急性排斥期角膜移植物基质细胞凋亡发生的规律 ,分析基质细胞凋亡与急性免疫排斥反应的关系。方法　建立大鼠穿透性角膜移植动物模型。实验分组 :A组 ,同种异体角膜移植组 ,Wistar→SD ;B组 ,同基因角膜移植组 ,Wistar→Wistar ;2移植组受者均为 10只。C组 ,正常对照非移植组 ,健康Wistar大鼠 10只。急性排斥期取材 ,应用细胞凋亡原位末端标记 (TUNEL法 )检测角膜基质细胞凋亡情况。对TUNEL染色结果采用全自动图像分析系统处理 ,计算阳性单位PU值。结果　与正常角膜及同基因角膜移植片相比 ,急性排斥期同种异体角膜植片基质细胞凋亡明显增多。各实验组阳性单位PU平均值分别为 :2 8 6 8± 3 6 4 ,10 80± 3 2 0 ,均明显高于对照组 2 72± 2 0 8,差异有显著性 (P 细胞凋亡可能是导致角膜移植排斥反应发生的主要因素之一。

关键词：角膜移植术角膜细胞凋亡角膜基质大鼠

细胞凋亡与角膜移植排斥和免疫耐受诱导的研究进展

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国际眼科纵览 2016年第5期40卷 352-356页

作者：耿雯雯王婷济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东省眼科医院

角膜移植是治疗角膜疾病的主要方法和手段,移植后的免疫排斥反应是导致角膜移植术失败的主要原因.细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的由基因控制的细胞自主性程序性死亡方式,与组织器官的发育、分化和正常生理活动的维持以及某些疾病病理... 详细信息

角膜移植是治疗角膜疾病的主要方法和手段,移植后的免疫排斥反应是导致角膜移植术失败的主要原因.细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的由基因控制的细胞自主性程序性死亡方式,与组织器官的发育、分化和正常生理活动的维持以及某些疾病病理过程的发生等有着密切的联系.角膜移植后同时存在浸润炎性细胞和角膜细胞的凋亡,浸润炎性细胞的凋亡导致免疫耐受,而角膜细胞的凋亡既可导致移植排斥,又可以诱导免疫耐受.

关键词：细胞凋亡角膜细胞免疫细胞角膜移植排斥免疫耐受

犬角膜上皮细胞及基质细胞原代培养的实验研究

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犬角膜上皮细胞及基质细胞原代培养的实验研究

准分子激光原位角膜磨镶术后角膜基质细胞凋亡的实验研究

全国兽医外科学第13次学术研讨会、小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会

作者：张玉霞卓国荣丁明星华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院华中农业大学动物医学院

报道了犬角膜上皮细胞和基质细胞的体外培养技术,成功地建立了犬角膜上皮细胞与基质细胞的原代培养方法并形成了良好的细胞单层。可用于犬角膜组织细胞的体外实验研究。

关键词：原代组织培养角膜细胞犬

来源： cnki会议评论

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浙江医学 2006年第7期28卷 548-551页

作者：盛艳杨亚波浙江大学医学院附属第一医院眼科杭州310003 浙江大学医学院附属第二医院眼科中心

目的了解准分子激光原位角膜磨镶术(laserinsitukeratomileusis,LASIK)后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探讨LASIK术后角膜基质细胞凋亡水平与角膜刀的机械损伤、激光切削的相关性。方法20只新西兰白兔40只眼随机分为4组,每组10只眼,A组... 详细信息

目的了解准分子激光原位角膜磨镶术(laserinsitukeratomileusis,LASIK)后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探讨LASIK术后角膜基质细胞凋亡水平与角膜刀的机械损伤、激光切削的相关性。方法20只新西兰白兔40只眼随机分为4组,每组10只眼,A组行单纯角膜瓣制作术,B组按-4.0D行LASIK术,C组按-8.0D行LASIK术,D组为空白对照。在术后4小时处死兔子取兔角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平差别。结果空白组角膜基质未出现凋亡细胞表达,其余3个手术组中角膜基质中均出现凋亡细胞,主要分布于角膜瓣与基质床交接面两侧50μm的角膜基质中;瓣缘的凋亡水平高于中央部。3个手术组的TUNEL阳性细胞计数进行方差分析,3组之间差异无显著意义(F=1.008,P>0.05)。结论LASIK术后早期即可出现角膜基质细胞的凋亡表达,该表达与角膜瓣的制作有关,与激光切削的深度无明显的相关性。

关键词：凋亡角膜细胞角膜基质准分子激光原位角膜磨镶术