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生物工程学报 2023年第10期39卷 4258-4274页

作者：刘宇晴夏媛媛沈微杨海泉陈献忠江南大学生物工程学院江苏无锡214122

仿果蝇眼睛的抗反射纳米涂层是一种具有巨大市场潜力的生物可降解材料,可用于制造各种需要抗反射性能的光学设备。相较于物理化学法,采用微生物表达视黄素蛋白为在温和条件下制备纳米涂层提供了新思路。然而,目前抗反射涂层的关键——... 详细信息

仿果蝇眼睛的抗反射纳米涂层是一种具有巨大市场潜力的生物可降解材料,可用于制造各种需要抗反射性能的光学设备。相较于物理化学法,采用微生物表达视黄素蛋白为在温和条件下制备纳米涂层提供了新思路。然而,目前抗反射涂层的关键——视黄素蛋白的表达水平较低,难以满足大规模生产。本研究通过分析筛选果蝇来源视黄素蛋白的最佳表达宿主,优化视黄素蛋白的表达水平,确定了中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)是视黄素蛋白的高效表达宿主,获得纯化的视黄素蛋白。同时,探索羊毛脂纳米乳液的制备方法,确定了特定浓度视黄素蛋白及与蜡乳液的比例为16:4,纳米涂层形成体系p H为7.0,温度为30℃时,纳米涂层的抗反射能力最佳。本研究为人工绿色可降解抗反射涂层的未来应用奠定基础,提供了蛋白表达优化思路,并通过纳米涂层的成分确定及体系成分浓度、p H及温度的优化,增强了人工抗反射纳米涂层的抗反射能力并降低了生产成本。

关键词：视黄素蛋白表达优化纳米涂层抗反射

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视黄素蛋白的表达优化及在纳米涂层材料中的应用

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作者：刘宇晴江南大学

学位级别：硕士

仿果蝇眼睛的抗反射涂层的发现提供了一种温和条件下通过可生物降解材料生产功能纳米结构涂层的方法。然而,目前抗反射能力涂层关键视黄素蛋白的表达量较低,人工纳米涂层抗反射能力有进一步优化的空间。为了提高该人工抗反射纳米涂层的... 详细信息

仿果蝇眼睛的抗反射涂层的发现提供了一种温和条件下通过可生物降解材料生产功能纳米结构涂层的方法。然而,目前抗反射能力涂层关键视黄素蛋白的表达量较低,人工纳米涂层抗反射能力有进一步优化的空间。为了提高该人工抗反射纳米涂层的抗反射能力并降低生产成本,本研究从纳米涂层的关键成分—视黄素蛋白和角膜蜡出发,对视黄素蛋白的表达进行了宿主优化及蛋白质工程改造,并进行基于抗反射能力的人工纳米涂层的优化。本研究的主要结果如下:(1)基于蛋白质工程优化表达视黄素蛋白。以大肠杆菌为宿主,通过N端序列优化、表达载体优化、融合蛋白和诱导条件优化等策略促进视黄素蛋白的表达。结果表明融合蛋白策略可以促进视黄素蛋白的表达,在融合增强型绿色荧光蛋白的基础上,N端短肽及连接肽的插入可以进一步提高蛋白表达量,其荧光强度是单独融合e GFP的4.8倍。最后,基于SKIK短肽建立随机突变库筛选高表达融合蛋白,筛选到一个短肽突变体SKFM,含有该短肽的融合蛋白比含SKIK短肽的融合蛋白荧光值高出50%;(2)探究视黄素蛋白的最佳表达宿主。分别在具有翻译后修饰,高蛋白质产量的毕赤酵母GS115、生长速度快和操作可行的大肠杆菌Rosetta gami2、与视黄素蛋白来源相近并适合分泌蛋白表达的昆虫细胞Sf9、高密度悬浮生长和易于表达难表达蛋白质的哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)这四种常用宿主中进行视黄素蛋白的表达,最后确定CHO细胞可以高效可溶表达视黄素蛋白,培养25 m L获得纯化的单一视黄素蛋白为3.75 mg;(3)建立羊毛脂纳米乳液的制备方法。通过超声乳化技术,在超声破碎仪超声破碎功率20%超声1 h后,获得粒度分布均匀,体系稳定的粒径为156.1 nm的纳米乳液,建立了羊毛脂纳米蜡乳液的有效方法;(4)优化纳米涂层的制备及抗反射能力。验证特异性视黄素蛋白与蜡形成纳米涂层的表征和抗反射能力,并确定纳米涂层形成体系中浓度比例、p H及温度对纳米涂层的表征和抗反射能力的影响。结果表明,单一视黄素蛋白在蛋白质与蜡乳液形成抗反射能力的纳米涂层具有特异性。在特定浓度视黄素蛋白与蜡乳液的比例为16:4,纳米涂层形成体系p H为7.0,温度为30℃的条件下,纳米涂层的乳头状结构最明显,抗反射能力最佳,此时涂层在400-750 nm波长范围内平均透射率为93.67%。本研究旨在探究视黄素蛋白在常用表达宿主中的潜力,并研究在大肠杆菌中常用蛋白表达优化方法对视黄素蛋白表达的影响。同时,通过纳米涂层的成分确定及体系成分浓度、p H及温度的优化,为人工绿色可降解抗反射涂层的未来应用奠定基础。

关键词：视黄素蛋白表达优化纳米涂层抗反射

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