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视蛋白3通过VEGFR-2调节人皮肤微血管内皮细胞的血管生成

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中国皮肤性病学杂志 2021年第7期35卷 740-745,757页

作者：罗欢欢兰应华曾雯董仙汪宇陆洪光贵州医科大学贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院皮肤科贵州贵阳550004

目的探讨视蛋白在人皮肤微血管内皮细胞中的表达,及其对皮肤微血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成的影响。方法通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别验证视蛋白的基因表达水平和蛋白表达水平。然后使用小干扰RNA技术沉默视蛋白3,分... 详细信息

目的探讨视蛋白在人皮肤微血管内皮细胞中的表达,及其对皮肤微血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成的影响。方法通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别验证视蛋白的基因表达水平和蛋白表达水平。然后使用小干扰RNA技术沉默视蛋白3,分别用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法验证视蛋白3的沉默效率。小干扰RNA成功沉默视蛋白3后,通过CCK-8法检测细胞的增殖活力,Transwell检测细胞的迁移能力,小管形成实验评估血管形成能力的情况。最后通过蛋白印迹法检测信号通路相关蛋白的表达情况。结果视蛋白1~5均在血管内皮细胞中表达,其中视蛋白3基因表达水平较其他视蛋白表达高,差异有统计学意义(P视蛋白3后,细胞的增殖、迁移、小管形成能力均减弱,差异有统计学意义(P蛋白血管内皮生长因子受体2、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶1/2、内皮型一氧化氮合酶的表达均降低。结论视蛋白3在人皮肤微血管内皮细胞中高表达,并调控血管形成,可能成为血管生成相关疾病的一个潜在治疗靶点。

关键词：视蛋白3 血管内皮细胞 VEGFR-2 血管生成

视蛋白3对人真皮成纤维细胞增殖、迁移、周期及Ⅰ型胶原蛋白生成的作用及机制研究

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视蛋白3对人真皮成纤维细胞增殖、迁移、周期及Ⅰ型胶原蛋白生成...

作者：牟慧玲贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:检测视蛋白(opsins,OPNs)在正常人真皮成纤维细胞中的表达,探索视蛋白3(opsin 3,OPN3)对成纤维细胞增殖、迁移、周期及I型胶原蛋白生成的影响及分子机制。方法:1、取4-12岁健康小儿包皮用Dispase酶消化过夜后真表皮分离,真皮组织... 详细信息

目的:检测视蛋白(opsins,OPNs)在正常人真皮成纤维细胞中的表达,探索视蛋白3(opsin 3,OPN3)对成纤维细胞增殖、迁移、周期及I型胶原蛋白生成的影响及分子机制。方法:1、取4-12岁健康小儿包皮用Dispase酶消化过夜后真表皮分离,真皮组织贴块培养,待成纤维细胞爬出,培养、传代,至3-5代,用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)分别检测视蛋白1-5的转录水平及蛋白质水平,细胞免疫荧光检测视蛋白3及I型胶原蛋白的表达及定位。2、设计针对人视蛋白3的小干扰RNA,利用脂质体转染入正常人真皮成纤维细胞,分别用q RT-PCR、Western Blot检测对照组和实验组视蛋白3的表达水平。3、成功靶向沉默成纤维细胞视蛋白3后,分别用q RT-PCR、Western Blot、酶联免疫吸附测定及细胞免疫荧光检测I型胶原蛋白表达水平变化。4、通过CCK-8及EDU实验检测对照组和实验组成纤维细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell实验及细胞划痕实验检测细胞迁移能力。5、通过Western Blot检测通路蛋白PI3K、AKT及磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT的表达情况。6、使用AKT抑制剂MK-2206 2HCl抑制通路蛋白AKT的磷酸化,通过Western Blot检测I型胶原蛋白表达变化。结果:1、原代成纤维细胞从真皮组织块爬出,在倒置显微镜下观察细胞形态呈长梭形,细胞免疫荧光染色波形蛋白阳性。用q RT-PCR、Western Blot检测分析,视蛋白1-5在正常人真皮成纤维细胞中均有表达,其中视蛋白3基因及蛋白表达水平较其他视蛋白表达高(P视蛋白3后,q RT-PCR、Western Blot及细胞免疫荧光染色结果显示细胞合成I型胶原蛋白水平降低,酶联免疫吸附法结果显示细胞分泌I型胶原蛋白减少。3、CCK-8结果显示,与对照组RNAi-control相比,实验组RNAi-OPN3组细胞的增殖活力在24h、48h、72h随时间的增长而逐渐减弱;EDU结果显示,在48小时,RNAi-OPN3组细胞EUD阳性比例相较RNAi-control组明显降低;细胞划痕实验及Transwell实验结果显示RNAi-OPN3组细胞迁移距离较短、迁移数量较少;与RNAi-control相比,RNAi-OPN3组细胞周期中S期比例明显降低。4、沉默视蛋白3后,Western Blot检测RNAi-OPN3组通路蛋白p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平较RNAi-control组明显降低。5、用AKT抑制剂抑制通路蛋白AKT的活化后,细胞合成I型胶原蛋白水平降低。结论:本实验研究表明视蛋白3参与调控正常人真皮成纤维细胞增殖、迁移、周期和I型胶原蛋白的合成,视蛋白3通过PI3K/AKT通路调控成纤维细胞的I型胶原蛋白合成,可能是创伤愈合、纤维化相关疾病及医疗美容潜在的治疗靶点。

关键词：视蛋白3 成纤维细胞细胞增殖细胞迁移细胞周期 Ⅰ型胶原蛋白

视蛋白3在人皮肤微血管内皮细胞中的表达及对血管生成的影响

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视蛋白3在人皮肤微血管内皮细胞中的表达及对血管生成的影响

作者：罗欢欢贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:检测视蛋白（Opsins,OPNs）是否在人正常皮肤血管和血管内皮细胞中表达,并进一步探索OPNs是否参与血管的发育及可能的分子机制。方法:将人皮肤组织石蜡包块切片,通过组织免疫荧光法检测OPNs在人正常皮肤血管中的表达情况;培养人微... 详细信息

目的:检测视蛋白（Opsins,OPNs）是否在人正常皮肤血管和血管内皮细胞中表达,并进一步探索OPNs是否参与血管的发育及可能的分子机制。方法:将人皮肤组织石蜡包块切片,通过组织免疫荧光法检测OPNs在人正常皮肤血管中的表达情况;培养人微血管内皮细胞（HDMECs）株并在显微镜下观察细胞形态,通过CD31荧光染色鉴定;用免疫荧光检测并定位OPNs在HDMECs中的表达情况;实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）验证OPNs的核酸水平;蛋白质印迹法（Western-blot）用于检测OPNs的蛋白水平;将细胞分为Control组、NC-OPN3 组和Si-OPN3 组,用 siRNA靶向沉默OPN3,RT-PCR 和Western-blot检测沉默OPN3的效率;siRNA沉默OPN3成功后,通过Cell Counting Kit（CCK-8）检测细胞的增殖能力,用细胞划痕法和Transwell法检测细胞的迁移能力,体外小管形成实验验证血管形成能力的改变情况;通过Western-blot检测VEGFR-2,VEGFR-1,CaMKⅡ,PI3K/AKT,ERK1/2,eNOS信号通路相关蛋白的表达。结果:荧光显微镜下视蛋白（OPNs）各亚单位（OPN1-SW,OPN2,OPN3,OPN4,OPN5）与血管内皮细胞标记物CD31（Platelet endothelialcall adhesion molecule-1）的共定位提示OPNs均在人皮肤血管中表达。细胞免疫荧光染色显示CD31 阳性,OPNs（OPN1-SW,OPN2,OPN3,OPN4,OPN5）在内皮细胞均有表达。通过RT-PCR和Western-blot分别分析OPNs的mRNA表达水平和蛋白表达水平,其中发现OPN3的表达水平显著高于其他视蛋白（p＜0.05）。用SiRNA以30nm的浓度沉默OPN3后,用CCK-8测定法测试不同时间点内皮细胞的增殖活力情况,发现与NC-OPN3组比较、Si-OPN3组的细胞增殖活力在转染后24h、48h、72h随时间的增长逐渐降低。随后用细胞划痕法和Transwell法检测细胞的迁移能力,发现与NC-OPN3组比较Si-OPN3组水平移动的距离明显较短,迁移的细胞数量也显著减少。体外小管形成实验结果显示与NC-OPN3组相比Si-OPN3组小管形成长度及分支明显减少。通过Western-blot分析,发现沉默OPN3后,血管内皮细胞血管形成依赖的VEGFR-2蛋白水平降低;同时发现VEGFR-1,CaMKII,PI3K/AKT相关蛋白磷酸化表达均下降,且与细胞增殖、迁移及通透性有关的分子ERK1/2和eNOS表达也降低。结论:视蛋白各亚型均在人皮肤组织血管中表达,其中视蛋白3在人皮肤微血管内皮细胞中高表达并且调节细胞的增殖、迁移、小管形成能力;它可能通过VEGFR-2受体进一步调控PI3K/AKT信号通路,影响血管形成,可为血管生成相关疾病的治疗提供一个潜在的靶点。

关键词：视蛋白3 VEGFR-2 血管内皮细胞血管生成

视蛋白3在人结节型基底细胞癌中的表达及功能研究

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视蛋白3在人结节型基底细胞癌中的表达及功能研究

作者：许佳贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:探索视蛋白3在人结节型基底细胞癌癌组织及癌旁组织的表达及差异,以及视蛋白3对基底细胞癌细胞增殖、迁移和凋亡的调节作用及相关分子调控机制。方法:1.收集贵州医科大学附属医院经皮肤镜、皮肤CT（皮肤反射式共聚焦显微成像,Refle... 详细信息

目的:探索视蛋白3在人结节型基底细胞癌癌组织及癌旁组织的表达及差异,以及视蛋白3对基底细胞癌细胞增殖、迁移和凋亡的调节作用及相关分子调控机制。方法:1.收集贵州医科大学附属医院经皮肤镜、皮肤CT（皮肤反射式共聚焦显微成像,Reflectance confocal microscopy,RCM）检查、病理活检确诊的31例头面部结节型基底细胞癌患者的临床资料及临床组织样品（癌组织及癌旁正常组织（Paired adjacent normal skin tissues,PANST））。利用免疫荧光染色法、蛋白印迹法（Western-blot,WB）和实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测视蛋白3（Opsin3,OPN3）在癌组织及癌旁正常组织中表达的情况。2.利用小干扰RNA技术下调基底细胞癌细胞（TE354T）中的OPN3,并将细胞分为三组:对照组（Control）、空载组（RNAi-NC）、视蛋白3敲低组（RNAi-OPN3）。首先通过RT-q PCR和WB实验验证si RNA是否沉默OPN3成功,沉默成功之后,对三组细胞分别进行Cell Counting Kit（CCK-8）实验检验基底细胞癌细胞的增殖活性,Transwell迁移实验以及细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,最后用Western-blot检测视蛋白3下游钙离子信号通路相关蛋白的表达情况。结果:1.结节型基底细胞癌在皮肤镜下见出血,亮红色分枝状血管,周边见蓝灰色卵圆形巢。皮肤CT在Z扫描下见真皮内细胞增生,轮辐状肿瘤团块和栅栏状结构,部分见噬色素细胞聚集;XY扫描见表皮细胞排列紊乱,表皮突消失,见肿瘤团块。病理HE染色提示真皮层见异型性、大小较一致的基底细胞组成,中心部细胞排列紊乱,肿瘤细胞周边的细胞呈栅栏状排列。免疫荧光染色发现OPN3在癌组织中广泛分布,Western-blot及RT-q PCR实验显示与癌旁组织相比,在癌组织中OPN3表达量较高。2.沉默OPN3后,通过CCK-8实验检测TE354T细胞增殖活性,发现视蛋白敲低组与对照组相比,其抑制率随时间的增长而增高。接下来通过Transwell迁移实验以及细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,发现OPN3敲低组与对照组相比,细胞迁移能力明显降低（P＜0.05）,流式细胞术结果显示沉默OPN3可促进细胞凋亡（P＜0.05）。最后通过Western-blot实验检验OPN3下游信号通路相关蛋白的表达情况,发现OPN3敲低组与对照组相比,参与钙通道相关蛋白p-CREB,p-CAMKⅡ表达下降。结论:OPN3在人结节型基底细胞癌癌组织的表达高于癌旁组织,并且可能是通过钙依赖G蛋白偶联受体信号通路调控基底细胞癌细胞增殖、迁移以及凋亡能力。

关键词：视蛋白3 人结节型基底细胞癌增殖迁移凋亡

长波紫外线对人黑素瘤细胞中视蛋白3的表达及细胞增殖的影响

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贵州医科大学学报 2024年第1期49卷 1-13页

作者：张玉蕾曾雯张伟董仙冯江龙靳姝琦罗欢欢刘婷陆洪光贵州医科大学临床医学院皮肤病与性病学教研室贵州贵阳550004 贵州医科大学附属医院皮肤科贵州贵阳550004 贵州医科大学附属医院病理科贵州贵阳550004

目的研究长波紫外线对人黑素瘤细胞中视蛋白3(OPN3)的表达及对细胞增殖的影响。方法利用不同剂量的UVA分别照射人黑素瘤细胞系(A375细胞和MV3细胞)后,通过5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验及细胞增殖与活性检测试剂(CCK-8)检测照射... 详细信息

目的研究长波紫外线对人黑素瘤细胞中视蛋白3(OPN3)的表达及对细胞增殖的影响。方法利用不同剂量的UVA分别照射人黑素瘤细胞系(A375细胞和MV3细胞)后,通过5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验及细胞增殖与活性检测试剂(CCK-8)检测照射前后细胞的增殖情况,实时荧光定量(RT-qPCR)分别检测细胞中视蛋白(OPN)的mRNA表达水平;利用慢病毒技术分别沉默和过表达A375细胞和MV3细胞中的OPN3,采用EdU实验及CCK-8方法检测细胞的增殖水平;沉默A375细胞和MV3细胞中OPN3后进行UVA照射,通过EdU及CCK-8方法检测照射前后细胞增殖的变化;采用转录组测序技术检测过表达及沉默OPN3的MV3细胞中差异基因的表达,并进行KEGG富集相关信号通路分析,免疫印迹法(Western blot)验证Hippo信号通路相关蛋白的表达情况。结果与Control组相比,UVA照射组中的细胞增殖能力明显增强(P3、OPN4以及OPN5在A375和MV3细胞中均有表达,其中OPN3的转录表达水平水平均明显高于其他OPN(P375和MV3细胞OPN3蛋白表达水平明显升高,沉默OPN3的表达后,A375和MV3细胞的增殖能力减弱,过表达OPN3后A375和MV3细胞的增殖能力增强(P375细胞和MV3细胞)OPN3后经UVA照射,细胞增殖能力较单纯照射UVA时降低(P3细胞中OPN3的表达后,RNA-seq测序结果筛选出141个差异基因,KEGG分析筛选差异基因富集信号通路9条,其中-Log10(FDR)值最高的为Hippo信号通路;沉默OPN3后,检测到LATS1表达水平增加,p-YAP、YAP、RhoA蛋白表达水平降低(P375细胞和MV3细胞)OPN3的表达,并通过Hippo信号通路调控细胞的增殖过程。

关键词：视蛋白3 黑素瘤增殖长波紫外线转录组测序技术 Hippo信号通路

人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白3的表达及功能

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贵州医科大学学报 2023年第6期48卷 652-660页

作者：许佳韩宁章俊兰应华辜阳广罗欢欢杨玉麟汪宇陆洪光贵州医科大学临床医学院皮肤病与性病学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院皮肤科贵州贵阳550004

目的探讨人结节型皮肤基底细胞癌(BCC)病变组织及细胞株中视蛋白3(OPN3)的表达及功能。方法选取31例结节型BCC患者病灶组织及相邻癌旁正常组织(PANST)分别作为病灶组及PANST组,采用免疫荧光染色法检测OPN3的表达,Western blot及实时荧... 详细信息

目的探讨人结节型皮肤基底细胞癌(BCC)病变组织及细胞株中视蛋白3(OPN3)的表达及功能。方法选取31例结节型BCC患者病灶组织及相邻癌旁正常组织(PANST)分别作为病灶组及PANST组,采用免疫荧光染色法检测OPN3的表达,Western blot及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测2组标本组织中OPN3蛋白及mRNA的表达;取对数生长期的人BCC细胞株TE354T,分为对照(Control)组、空白(RNAi-NC)组及实验(RNAi-OPN3)组,并设计针对人OPN3的小干扰RNA转染TE354T细胞,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测OPN3下调后0、24、48及72 h RNAi-NC组及RNAi-OPN3组的细胞增殖活性,采用Transwell迁移和细胞划痕实验检测OPN3下调48 h后2组细胞的迁移能力,采用流式细胞术和Western blot分别检测OPN3下调48 h后2组细胞凋亡数量及钙通道相关蛋白环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)、钙调蛋白依赖激酶Ⅱ(CAMKⅡ)、磷酸化CAMKⅡ(p-CAMKⅡ)的表达。结果与PANST组比较,病灶组BCC组织中OPN3表达增高(P3后72 h,RNAi-OPN3组TE354T细胞增殖活性较RNAi-NC组下降(P3后48 h,与RNAi-NC组相比,RNAi-OPN3组TE354T细胞迁移能力降低(P354T细胞凋亡细胞数量增加(P354T细胞钙通道相关蛋白p-CREB和p-CAMKⅡ表达下降(P3在人结节型BCC组织中高表达,可调控人BCC系TE354T细胞的增殖、迁移及凋亡,其机制可能与钙依赖G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路有关。

关键词：细胞增殖细胞凋亡视蛋白3 G蛋白偶联受体人结节型基底细胞癌迁移