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视网膜铺片小胶质细胞2种染色计数方法的比较

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第三军医大学学报 2011年第20期33卷 2214-2215页

作者：于嘉吴楠王一第三军医大学西南医院全军眼科中心重庆400038

目的比较2种视神经损伤后行视网膜铺片小胶质细胞染色计数方法的准确性。方法取Long Evans大鼠6只,荧光金经双侧上丘及外侧膝状体逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),7 d后制作视神经钳夹伤模型。钳夹伤后2周麻醉... 详细信息

目的比较2种视神经损伤后行视网膜铺片小胶质细胞染色计数方法的准确性。方法取Long Evans大鼠6只,荧光金经双侧上丘及外侧膝状体逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),7 d后制作视神经钳夹伤模型。钳夹伤后2周麻醉处死大鼠,将大鼠灌注固定后取眼球剥离完整视网膜,置于4%多聚甲醛中后固定2 h,3只大鼠行视网膜铺片对荧光金标记的小胶质细胞进行计数,其余3只在视网膜固定后运用CD11b单克隆抗体免疫组化双重标记小胶质细胞后再行铺片计数。结果视神经损伤后,活化的小胶质细胞吞噬了死亡RGCs碎屑而被荧光金着色,联合小胶质细胞免疫组化的染色方法能够更加清楚地在视网膜铺片上分辨出活化的小胶质细胞和存活的RGCs,荧光金标记与双重标记小胶质细胞的计数分别为(240.0±7.9)、(406.0±9.1)个/mm2。结论运用荧光金联合免疫组化双重标记小胶质细胞能够较为准确地对视神经损伤后活化的小胶质细胞进行计数,是研究小胶质细胞更准确有效的染色方法。

关键词：小神经胶质细胞视网膜铺片染色方法大鼠

糖尿病大鼠血-视网膜屏障功能评估中伊文思蓝灌注视网膜铺片技术的改良和应用

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中华实验眼科杂志 2015年第7期33卷 606-609页

作者：董蒙陈松段红涛王月欣孔佳慧李泽东王昀天津医科大学眼科临床学院天津市眼科医院天津市眼科学与视觉科学重点实验室天津市眼科研究所 300020

背景伊文思蓝（EB）灌注的大鼠视网膜铺片是实验研究过程中观察血-视网膜屏障（BRB）功能的常用方法,但以往视网膜标本经固定液处理后透光性差,仅能用激光扫描共焦显微镜进行观察,对实验设备要求较高. 目的探讨EB灌注糖尿病（DM）大... 详细信息

背景伊文思蓝（EB）灌注的大鼠视网膜铺片是实验研究过程中观察血-视网膜屏障（BRB）功能的常用方法,但以往视网膜标本经固定液处理后透光性差,仅能用激光扫描共焦显微镜进行观察,对实验设备要求较高. 目的探讨EB灌注糖尿病（DM）大鼠视网膜后在PBS中制作透明视网膜标本,并用普通荧光显微镜观察BRB功能技术的可行性. 方法应用随机数字表法将40只SD大鼠随机分为对照组、DM1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组.将质量分数2％链脲佐菌素（STZ）溶于0.05 mmol/L枸橼酸缓冲液,以60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射建立大鼠DM模型,对照组大鼠腹腔内注射等容量枸橼酸缓冲液.分别于造模后1、3、6个月按45 mg/kg的剂量经大鼠股静脉注射30 g/L的EB溶液,注射后15 min摘除双侧眼球,立即置于PBS中完整剥离视网膜,将视网膜放射状切开并平铺于载玻片上,避光晾至完全透明,封片,置于荧光显微镜下观察并拍照.应用IPP6.0软件分析图像,测量EB渗漏区面积与视网膜面积的百分比. 结果对照组大鼠视网膜血管形态和走行正常,EB在波长546 nm激发光下呈红色荧光,均匀充盈于血管腔.DM 1个月组大鼠视网膜背景荧光较对照组大鼠略增强;DM 3个月组大鼠视网膜背景荧光进一步增强,视网膜血管呈现节段性扩张,可见明显的红色高荧光区;DM 6个月组大鼠视网膜血管粗细不均,部分走行迂曲,可见片状低灌注区及大量高荧光区.对照组、DM 1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组EB渗漏区面积百分比分别为（0.05±0.02）％、（0.27±0.06）％、（1.17±0.1 8）％和（4.77±0.66）％,总体比较差异有统计学意义（F=795.800,P＜0.001）,其中DM 3个月组和DM 6个月组大鼠视网膜EB渗漏区面积百分比值明湿高于对照组,差异均有统计学意义（q＆#39;=10.338、43.475,均P＜0.001）. 结论改良的EB灌注视网膜铺片技术操作简单,普通荧光显微镜下即可清晰显示DM大鼠的BRB结构和动态变化.

关键词：视网膜铺片糖尿病视网膜病变动物模型 Sprague-Dawley大鼠血-视网膜屏障伊文思蓝

改良视网膜铺片联合免疫荧光染色技术在氧诱导视网膜病变模型中的应用

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中华实验眼科杂志 2016年第12期34卷 1077-1080页

作者：李蓉姚国敏王小娣西安医学院第一附属医院眼科 710077

背景氧诱导视网膜病变（OIR）动物模型的视网膜铺片是缺血性视网膜病变研究的有用工具。OIR大鼠或小鼠的幼鼠视网膜面积小且厚，采用传统方法先剪开视网膜再进行铺片实际操作难度较大，影响了对实验结果的定量分析。目的探讨一种易操作... 详细信息

背景氧诱导视网膜病变（OIR）动物模型的视网膜铺片是缺血性视网膜病变研究的有用工具。OIR大鼠或小鼠的幼鼠视网膜面积小且厚，采用传统方法先剪开视网膜再进行铺片实际操作难度较大，影响了对实验结果的定量分析。目的探讨一种易操作、稳定性好的鼠视网膜铺片联合免疫荧光染色技术。方法采用随机数字表法将40只出生后〈6h的SD大鼠随机分为OIR模型组和正常对照组，OIR模型组幼鼠与母鼠一起以24h的时间间隔交替在体积分数80％高氧环境或21％常氧环境中喂养14d，正常对照组大鼠在常氧环境中喂养。于喂养至14d时摘除眼球并剥离视网膜，对完整的视网膜先行谷氨酰胺合成酶（GS）-isolectin B4染色，然后展平视网膜铺片并呈放射状切为4瓣，并于荧光显微镜下拍照，应用Adobe Photoshop CS3图像分析软件系统进行图像拼接处理，获得全视网膜血管图像，采用软件测量每张完整视网膜铺片图像中无血管区及整个视网膜的像素值，最后计算无血管区的像素百分比进行无灌注区严重程度分析。结果采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法可见视网膜结构完整，展开的视网膜铺片平整，视网膜全周均可见锯齿缘结构。视网膜血管呈强的绿色荧光，血管分支清晰可见，而视网膜的背景绿色荧光较弱。正常对照组大鼠视网膜铺片显示其血管基本发育完全，OIR模型组大鼠视网膜铺片可显示中央视盘旁无毛细血管区及周边大片无血管区形成。结论采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法制备视网膜铺片简便、易行，较传统的视网膜铺片法更容易确保视网膜结构的完整性，有利于OIR模型视网膜血管形态学的观察和分析。

关键词：视网膜血管/病理氧/毒性新生动物 SD大鼠氧诱导视网膜病变视网膜铺片

应用视网膜铺片和神经元逆行标记技术测定神经节细胞密度分布

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国际眼科杂志 2007年第3期7卷 654-657页

作者：徐西彬陈耀星王子旭董玉兰曹静刘妍妍中国农业大学动物医学院中国北京市100094

目的:为视网膜神经节细胞(retina ganglion cell,RGC)的准确定量研究提供形态学的指标依据。方法:联合应用Nissl染色法和神经元逆行标记技术,并通过计算机图像处理技术测定RGC的形态分布特征。结果:两种标记方法在视网膜组织中标记的细... 详细信息

目的:为视网膜神经节细胞(retina ganglion cell,RGC)的准确定量研究提供形态学的指标依据。方法:联合应用Nissl染色法和神经元逆行标记技术,并通过计算机图像处理技术测定RGC的形态分布特征。结果:两种标记方法在视网膜组织中标记的细胞形态、大小和密度分布呈现明显的差异。Nissl染色可以使所有细胞着色,神经元逆行标记技术仅使RGC着色。通过两者的综合分析,在RGC等密度曲线图中可以观察到在视神经乳头下方形成一个沿鼻颞侧轴方向伸展的高密度区,即视条纹,由视条纹至周边部细胞密度递减。结论:联合应用视网膜铺片法和神经元逆行标记技术两者的优点,能够较准确地测定RGC的密度、大小及其分布等形态特征。

关键词：视网膜铺片神经节细胞分布细胞密度细胞大小

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小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术的探讨

眼科新进展 2010年第8期30卷 714-717页

作者：窦方方刘廷董晓光青岛大学医学院山东省青岛市266071 山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地山东省青岛市266071

目的探讨一种简便、易操作的小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术。方法 30只C57BL/6J成年小鼠行40g.L-1多聚甲醛心脏灌注固定,摘取眼球,剥离视网膜,随机分为3组:A组20个视网膜直接置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育1h;B组20个视网膜先置入甲... 详细信息

目的探讨一种简便、易操作的小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术。方法 30只C57BL/6J成年小鼠行40g.L-1多聚甲醛心脏灌注固定,摘取眼球,剥离视网膜,随机分为3组:A组20个视网膜直接置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育1h;B组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30min,再置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育1h;C组20个视网膜先置入甲醇冰上固定30min,再置于3g.L-1TritonX-100中4℃孵育过夜。各组分别行α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色,荧光显微镜下照相,观察其差异。结果荧光显微镜下观察,A组视网膜血管荧光微弱,血管模糊不清;B组视网膜可见荧光,血管分枝清晰可见,但荧光较弱;C组视网膜荧光强亮,α-平滑肌肌动蛋白特异性表达在血管内皮细胞及周细胞的胞膜上,荧光呈空泡状,背景染色轻。结论视网膜铺片免疫荧光染色是一种较好的、简便易行的视网膜组织形态学观察方法,实验过程中甲醇脱脂处理和足够的TritonX-100浸泡是保证染色成功的关键。

关键词：视网膜铺片免疫荧光小鼠眼球

小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨

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眼科新进展 2009年第9期29卷 663-666页

作者：孟丽娜刘廷董晓光山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验室--省部共建国家重点实验室培育基地山东省青岛市266071

目的探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片技术。方法30只生后12～17d龄C57BL/6J小鼠麻醉后行20g.L-1伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取双眼眼球,40g.L-1多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,... 详细信息

目的探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片技术。方法30只生后12～17d龄C57BL/6J小鼠麻醉后行20g.L-1伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取双眼眼球,40g.L-1多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,C组20只眼球固定40min,手术显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体及巩膜,并将视网膜平铺于载玻片上,荧光显微镜下照相,观察各组差异。结果大体观察:A组视网膜变大、变薄、变形,视网膜面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜黏附黑色视网膜色素上皮层,不易分离。荧光显微镜下照相观察:A组铺片成功率为30%,视网膜血管变形,模糊不清;B组铺片成功率为90%,视网膜血管均匀规则分布;C组铺片成功率为30%,黑色视网膜色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀。结论良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键。

关键词：血管造影组织固定视网膜铺片小鼠眼球

大鼠OIR模型中视网膜铺片异凝集素直接染色技术的探讨

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西北国防医学杂志 2014年第5期35卷 439-442页

作者：任兵田丽丽罗英解放军474医院全军眼科中心新疆乌鲁木齐830013 石河子大学医学院

目的:探讨一种在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)动物模型中简单易行的视网膜铺片染色的技巧及新生血管定量的方法。方法:7 d龄SD大鼠建立OIR模型,分别于P12、P14、P16、P17、P24处死,做视网膜铺片,进行异凝集素染色... 详细信息

目的:探讨一种在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)动物模型中简单易行的视网膜铺片染色的技巧及新生血管定量的方法。方法:7 d龄SD大鼠建立OIR模型,分别于P12、P14、P16、P17、P24处死,做视网膜铺片,进行异凝集素染色,观察视网膜新生血管情况。结果:经过反复探索,视网膜可完整的铺展,经异凝集素染色后能清晰地呈现出视网膜新生血管情况。结论:掌握各步骤细节操作的技巧是保证大鼠视网膜铺片成功的关键。

关键词：异凝集素视网膜铺片直接染色氧诱导视网膜病变

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糖尿病大鼠视网膜血管铺片技术的改进及运用

四川解剖学杂志 2001年第2期9卷 91-92页

作者：潘琳盛瑞红周水平彭俊云中日友好医院临床医学研究所北京100029 中日友好医院中医糖尿病科北京100029

目的:视网膜铺片技术难度较大,往往不易制出各实验组均一的、理想的视网膜微血管铺片.我们对原有方法在消化技巧、消化时间、展片等方面进行了改进并取得较好效果.方法:1.模型建立:6m糖尿病模型,180～200g雄性W istar大鼠60只,随机分成... 详细信息

目的:视网膜铺片技术难度较大,往往不易制出各实验组均一的、理想的视网膜微血管铺片.我们对原有方法在消化技巧、消化时间、展片等方面进行了改进并取得较好效果.方法:1.模型建立:6m糖尿病模型,180～200g雄性W istar大鼠60只,随机分成糖尿病组,糖尿病治疗1、2、3、4组,正常对照组, 每组10只,实验组经尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)50m g/kg,正常对照组注射生理盐水.定期测血糖、尿糖及体重.2.取材固定:颈动脉取血,取双侧眼球固定于4%多聚甲醛液中48hr.3.消化:沿距齿缘剪开眼球去除晶状体,用蒸馏水漂洗数次.以视神经乳头为中心将眼球壁均匀地剪成三等份,剥离眼球壁视网膜层,用甘胺酸缓冲液浸泡24hr 4℃.每组再分为振荡消化组和常规消化组.将剥离出的视网膜分别放入10Lm 3%胰酶液中,37℃进行消化.振荡消化组:间隔20m in摇晃一次;常规消化组:静止消化.两组均分别消化2、2.5、3hr三个时相.4 .铺片:用吸管将半透明状的血管网移入蒸馏水中漂洗数次,用吸管轻吹打非透明状区域, 将吹打成透明状的血管网取放在载玻片上,展平,自然干燥.5.染色:shciff试剂染色20min,10%偏重亚硫酸钠液洗3次,每次洗***氏苏木素染 2min,冲洗5min,脱水、透明、封片.结果:振荡消化组:2、2.5、3hr各实验组均获得消化程度均匀一致、无残存的视网膜各层细胞,血管形态结构清晰,染色艳丽的视网膜血管铺片.可清楚观察血管的行走、管径的变化、内皮细胞及周细胞的比例等.常规消化组:2、2.5、3hr消化,经吹打后仍有多少不等残存的视网膜各层细胞,各组均未完整显示出视网膜血管.讨论:DR的发病机制迄今尚不十分清楚,长期高血糖是发病的基础.主要病理形态改变是微血管闭塞和微血管瘤形成.这些改变用光镜和电镜切片技术难以观察.视网膜铺片技术已在实验研究中运用多年,但由于其技术操作较难,步骤较繁锁 ,特别是大量成批的动物实验时很难制出均一、理想的铺片,严重影响了对实验结果的分析 .本实验对该方法的改进,为探讨DR发病机理及早期防治提供了新的技术手段.

关键词：视网膜血管铺片视网膜铺片眼球壁

改良视网膜墨汁灌注法观察先天性静止性夜盲对视网膜新生血管的影响

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中华实验眼科杂志 2017年第10期35卷 885-889页

作者：宋玫侠李上牛超张作明解放军第一五三中心医院眼科郑州450007 河南省立眼科医院河南省眼科研究所郑州450003 第四军医大学航空航天医学系西安710032

背景先天性静止性夜盲（CSNB）是一种常见的眼科遗传性疾病。CSNB较少见到视网膜新生血管，其如何影响视网膜新生血管尚需深入探讨。目的改进视网膜墨汁灌注方法，并用于观察CSNB对视网膜新生血管生成的影响。方法选取清洁级7日龄SD大鼠... 详细信息

背景先天性静止性夜盲（CSNB）是一种常见的眼科遗传性疾病。CSNB较少见到视网膜新生血管，其如何影响视网膜新生血管尚需深入探讨。目的改进视网膜墨汁灌注方法，并用于观察CSNB对视网膜新生血管生成的影响。方法选取清洁级7日龄SD大鼠和CSNB大鼠各18只，任意选取其中12只制作氧诱导视网膜病变（OIR）模型作为OIR模型组，其余6只作为正常对照组。OIR模型组SD大鼠和CSNB大鼠各9只按照随机数字表法随机分为体积比1∶1墨汁灌注组、体积比2∶1墨汁灌注组和单纯墨汁灌注组，分别灌注体积比1∶1墨汁灌注液、体积比2∶1墨汁灌注液和单纯墨汁灌注液各10 ml。取单侧眼球制作视网膜铺片，取另一侧眼球制作石蜡切片。观察并比较不同体积比墨汁灌注组视网膜血管成像质量。另取SD大鼠和CSNB大鼠OIR组各3只幼鼠与正常对照组幼鼠均按照此法灌注体积比2∶1墨汁灌注液。取各组石蜡切片行组织病理学观察并计数每张切片中突破内界膜细胞核的数量。免疫组织化学法检测视网膜中血管性血友病因子（v-WF）的表达。结果体积比2∶1墨汁灌注组视网膜铺片中血管网成像质量较体积比1∶1墨汁灌注组和单纯墨汁灌注组高。组织病理学检查显示，正常对照组大鼠视网膜各层组织结构未见明显异常，SD大鼠和CSNB大鼠均未见突破内界膜的细胞核；OIR模型组可见大量内皮细胞核突破内界膜，OIR模型组中SD大鼠和CSNB大鼠突破内界膜的细胞核数量分别为（23.08±2.99）个/切片和（41.12±9.36）个/切片。CSNB大鼠突破内界膜的细胞核数量略高于SD大鼠，但差异无统计学意义（q＝1.70，P＝0.50）。免疫组织化学检查结果显示，SD大鼠和CSNB大鼠突破内界膜的细胞v-WF均表达阳性。结论体积比2∶1墨汁明胶灌注液对大鼠视网膜血管成像质量优于单纯墨汁灌注液，是一种重复性好、操作简单的视网膜铺片方法。高氧可诱导CSNB大鼠视网膜新生血管生成。

关键词：视网膜新生血管先天性静止性夜盲墨汁灌注视网膜铺片