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西藏野生大麦HvbHLH56介导的低氮耐性机理研究

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西藏野生大麦HvbHLH56介导的低氮耐性机理研究

作者：梁小利济南大学

学位级别：硕士

氮素是供植物生长的必要营养元素,也是农业生产中提升作物产量的限制因素。近年来,氮肥的过度使用引发环境污染问题。进一步剖析作物的低氮耐性机理对于减轻作物对氮肥的依赖,促进农业的快速发展意义重大。前期通过野生大麦中鉴定到的... 详细信息

氮素是供植物生长的必要营养元素,也是农业生产中提升作物产量的限制因素。近年来,氮肥的过度使用引发环境污染问题。进一步剖析作物的低氮耐性机理对于减轻作物对氮肥的依赖,促进农业的快速发展意义重大。前期通过野生大麦中鉴定到的低氮耐受品种XZ149的转录组分析,鉴定到一个归属于bHLH家族的耐低氮候选基因。本研究首先在全基因组水平上,筛选鉴定大麦bHLH家族成员,并分析了该家族成员的特性及进化关系。因与水稻基因Os01g72730(OsbHLH056)同源性最高,该候选基因被命名为HvbHLH56。随后,在西藏野生大麦XZ149中克隆了该基因,并通过其亚细胞定位以及低氮胁迫下在拟南芥中的过表达解析其对低氮的响应机理。本研究的主要结果如下:1、运用生物信息学方法,对大麦bHLH家族成员进行筛选,共鉴定到132个HvbHLH转录因子成员。其中126个不均匀地分布在大麦的7条染色体上,有6个未定位于任何染色体上。理化性质分析显示大麦bHLH编码的蛋白由86-767个氨基酸残基构成,分子量最大达到83538.67 Da,最小值为12014.64 Da,等电点pI的范围为4.63-11.9。多序列比对、基因结构、基序、系统进化树分析结果显示大麦bHLH家族分为24个亚家族,每个亚家族间的基因结构和基序都有所差异,同一亚家族中外显子/内含子数和基序结构基本一致。GO富集分析表明大麦bHLH基因在分子生物学功能有显著富集,具有DNA结合、蛋白二聚活性和蛋白结合功能。2、在西藏野生大麦低氮耐受基因型XZ149中成功克隆到HvbHLH56基因。并构建了HvbHLH56:GFP过表达载体。其在烟草中的瞬时表达显示蛋白在细胞核和细胞膜表达。3、使用农杆菌介导方法获得过表达HvbHLH56拟南芥,并加代繁殖获得纯合的过表达HvbHLH56拟南芥。在低氮胁迫下,转基因拟南芥的地上部鲜重和侧根数的降幅显著低于野生型;同时转基因拟南芥的根长增加或者变化不显著,野生型根长明显降低;表明HvbHLH56在拟南芥中的过表达显著缓解了低氮对其生长的抑制作用。此外,低氮条件下,转基因拟南芥的硝态氮含量、可溶性蛋白含量的降幅显著低于野生型,而硝酸还原酶、谷氨酰胺合酶和谷氨酸合酶的活性增幅高于野生型。这些结果表明,HvbHLH56在拟南芥中的过表达可增强其在氮素不足的情况下的氮素吸收同化能力,这可能是基因HvbHLH56增强转基因植株的低氮耐受性的一个重要原因。

关键词：西藏野生大麦 HvbHLH56 耐低氮亚细胞定位低氮胁迫

西藏野生大麦HvNRT2.6响应逆境胁迫的功能分析

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西藏野生大麦HvNRT2.6响应逆境胁迫的功能分析

作者：张宁济南大学

学位级别：硕士

氮(N)是植物生长发育过程中需求量最大的矿质营养元素,缺氮是限制作物产量的重要因素之一。农业生产上常通过增施氮肥来提高作物产量,然而氮肥的过度使用会引起一系列环境问题,不利于绿色高效农业的发展。培育耐低氮且高产的作物品种是... 详细信息

氮(N)是植物生长发育过程中需求量最大的矿质营养元素,缺氮是限制作物产量的重要因素之一。农业生产上常通过增施氮肥来提高作物产量,然而氮肥的过度使用会引起一系列环境问题,不利于绿色高效农业的发展。培育耐低氮且高产的作物品种是解决上述问题的一条有效途径。西藏野生大麦拥有丰富的遗传多样性,蕴含优异的抗逆基因。前期以两个低氮耐性差异显著的西藏野生大麦品种(XZ149,低氮耐受品种;XZ56,低氮敏感品种)为研究材料,通过比较转录组分析鉴定到大量响应低氮胁迫的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),其中一个DEG为编码高亲和硝酸盐转运蛋白的Hv NRT2.6。目前,已有大量研究证实NRT2家族基因在增强植物低氮耐性方面具有重要作用。因此,本研究首先从XZ149中成功克隆出Hv NRT2.6,并进一步分析其分子特征和表达特性。随后,构建Hv NRT2.6过表达拟南芥株系,解析该基因的低氮响应功能。因农业生产中常遭受盐和干旱胁迫,影响作物对养分的吸收利用;我们同时利用构建的拟南芥过表达株系,初步探索Hv NRT2.6在盐和干旱胁迫响应中的功能。本研究的主要结果如下:Hv NRT2.6 CDS全长为1524 bp,其编码蛋白由507个氨基酸组成,分子量为54.67k Da,等电点p I为8.39。该基因仅含一个外显子,包含Major Facilitator Superfamily(MFS)超家族结构域。利用烟草叶片表皮和拟南芥根尖分析Hv NRT2.6亚细胞定位,结果显示该蛋白定位于细胞膜。半定量分析表明,Hv NRT2.6主要在大麦的根中表达,且在低氮耐受品种XZ149中表达量较高。荧光定量分析发现,低氮胁迫下,Hv NRT2.6的表达具有组织、时间和基因型特异性。系统发育分析表明大麦Hv NRT2.6与水稻Os NRT2.1进化关系最近,推测其可能通过促进硝酸盐的吸收及根系发育等响应低氮胁迫。总体而言,在低氮胁迫下,过表达拟南芥株系(OE1、OE2和OE3)的地上部鲜重、根长、侧根数等均显著高于野生型拟南芥(WT),说明Hv NRT2.6的过表达可以显著提高拟南芥的低氮耐性。这可能是因为过表达株系保持良好的根系生长以及较为稳定的氮同化酶活性,从而使其在有限的氮素营养条件下吸收更多的硝态氮并更充分利用。在低盐胁迫下,过表达株系地上部鲜重显著增加,而WT地上部鲜重则显著降低;过表达株系和WT根长均显著降低,且过表达株系降幅小于WT;说明Hv NRT2.6的过表达可以显著提高拟南芥的耐盐能力。在干旱胁迫下,过表达株系地上部鲜重、根长、侧根数均显著降低,但其降幅均低于WT,说明Hv NRT2.6的过表达可以提高拟南芥的耐干旱能力。在盐和干旱胁迫下,过表达株系维持更好的代谢稳态,减弱其受到的氧化胁迫。同时,过表达株系中更多可溶性糖的消耗可能为根系等提供更多的能量与碳架,有利于根系的发育,使其在胁迫条件下,更好进行营养物质的吸收。

关键词：西藏野生大麦 HvNRT2.6 低氮耐性逆境胁迫

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西藏野生大麦休眠破除机制的初步研究

西藏野生大麦休眠破除机制的初步研究

作者：李鑫浙江大学

学位级别：硕士

种子休眠是植物适应自然环境的重要手段,有助于植物体种群繁衍以应对不良自然环境的影响。西藏野生大麦起源于我国青藏高原地区,是我国特有的野生大麦种质资源,其遗传多样性丰富。西藏野生大麦因其起源地独特的地理自然环境产生了独特... 详细信息

种子休眠是植物适应自然环境的重要手段,有助于植物体种群繁衍以应对不良自然环境的影响。西藏野生大麦起源于我国青藏高原地区,是我国特有的野生大麦种质资源,其遗传多样性丰富。西藏野生大麦因其起源地独特的地理自然环境产生了独特的休眠机制,在育种上具有特殊的意义。然而,种子休眠受到的复杂的内源信号网络调控尚未被完全解析。本研究以西藏野生大麦为材料,通过基于RNA-seq的转录组和代谢组的研究方法,探究西藏野生大麦种子在后熟作用和低温层积过程中休眠破除机制,取得的主要研究结果有:1.西藏野生大麦种子对低温层积和后熟作用的响应6个不同西藏野生大麦基因型种子在低温层积和后熟作用处理的过程中,种子发芽率都出现显著提高,休眠减弱的情况。显示无论低温层积或者是后熟作用都可以有效的打破西藏野生大麦种子的休眠。低温层积的过程中,6个西藏野生大麦基因型种子出现萌发的情况,表明一些西藏野生大麦基因型可以在4℃低温条件下萌发。2.后熟作用过程中西藏野生大麦种子代谢物变化分析对不同时间后熟作用处理的西藏野生大麦种子代谢物进行分析发现,甘油磷酸代谢途径;半乳糖代谢途径和淀粉、蔗糖代谢途径在休眠破除的过程中起到重要的作用。甘油磷酸代谢途径中变化最大的差异代谢物磷脂酸是公认的ABA信号途径的中间物质。3.低温层积过程中西藏野生大麦种子基因表达变化分析通过低温层积过程中基因表达情况的分析可知,低温层积快速破除种子休眠是由于种子内部系列改变引起的大麦种子对于ABA的信号响应变低。ABA信号途径中最为核心的PYL,PP2C,Sn RK2等基因的表达都出现变化,因此对于植物激素的信号感应变弱。植物激素特别是ABA也是低温层积过程中调控休眠的主要因素。

关键词：西藏野生大麦休眠低温层积后熟作用转录组代谢组

西藏野生大麦产量与农艺性状的相关分析与大麦叶色黄化突变体的基因定位

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西藏野生大麦产量与农艺性状的相关分析与大麦叶色黄化突变体的基...

作者：李志勇浙江大学

学位级别：硕士

大麦是世界重要的粮食作物之一,高产一直是大麦育种栽培的主要方向。大麦产量受多方面因素影响。本学位论文以西藏野生大麦和经EMS处理得到的叶色黄化突变体为材料,通过对产量与农艺性状的相关分析和对影响大麦产量的叶色黄化基因进行... 详细信息

大麦是世界重要的粮食作物之一,高产一直是大麦育种栽培的主要方向。大麦产量受多方面因素影响。本学位论文以西藏野生大麦和经EMS处理得到的叶色黄化突变体为材料,通过对产量与农艺性状的相关分析和对影响大麦产量的叶色黄化基因进行遗传分析和基因定位,找到在杭州气候条件下西藏野生大麦产量的主导性状,从分子水平上了解叶色黄化基因的遗传机理。主要研究结果有：西藏野生大麦产量与农艺性状的相关分析1.选取西藏野生大麦品种40份,其中二棱大麦20份,六棱大麦20份的农艺性状进行极差与变异系数等统计分析。结果显示群体内与群体间性状差异明显。说明了西藏野生大麦丰富的遗传多样性。2.对西藏野生六棱大麦进行相关性分析表明,各性状与产量的相关性大小顺序为：百粒重>株高>每穗粒数>穗长>穗下节长>分蘖数>芒长。通过通径分析及多元逐步回归分析发现株高、百粒重、每穗粒数和分蘖数与产量显著相关,其中与百粒重的直接相关系数最高,为0.829。各性状间的间接相关系数有正有负。在杭州地区气候环境条件下,最优的西藏野生六棱大麦的性状应为百粒重大,株高适中(中秆、矮秆),分蘖数和每穗粒数相对较少,同时注意各性状之间协调。3.对西藏野生二棱大麦进行产量相关性分析表明,各性状与产量相关的性状按相关性从大到小排列依次为每穗粒数>株高>芒长>穗长>分蘖数>百粒重>穗下节长,通过通径分析及多元逐步回归分析发现：株高、穗长、芒长、每穗粒数和分蘖数与产量相关,与每穗粒数的直接相关系数最高,为1.266。各性状相关关系复杂。在各性状协调发展情况下,性状为株高适中(中秆、矮秆),穗长长度适中,芒长长度中等偏长,每穗粒数极多的西藏野生二棱大麦则成为提高产量的优先选择。叶色黄化突变体研究1.通过对叶色黄化突变体大麦YLM的观察及农艺性状测量,发现其在整个生育期内均表现为叶色黄化,生育期延长。叶色黄化突变体YLM的农艺性状与对照品种相比,其株高、穗长、芒长均比对照品种高,其中穗长差异达到了极显著水平。而通过对成熟植株的茎秆重,穗重,单株产量进行对比发现,叶色黄化突变体的这三个性状数值均比对照组低,其中茎秆重与单株产量均达到极显著差异水平。产量与对照相比显著下降。2.以叶色黄化突变体YLM为母本与大麦品种XZ181杂交,从F2中随机观察200株,其中,植株叶色表现正常表型142株。叶色表现为黄化突变表型58株。经卡方检验X2=1.71

关键词：产量西藏野生大麦相关性分析叶色黄化突变体基因定位

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西藏野生大麦的分类和分布

中国农业科学 1987年第2期 1-6页

作者：马得泉徐廷文顾茂芝吴淑宝康运城中国农业科学院作物品种资源所四川农业大学西藏自治区农牧科学院西藏自治区山南地区农业科学研究所

本文报道西藏野生大麦资源的4年考察结果;叙述它们的历史发现过程、分类、分布、形态特征;确定它们属于1个种、2个亚种和48个变种,其中新变种38个,包括已报道的16个变种。西藏野生大麦具有分布地区广泛、变种多为重叠分布、变异类型多... 详细信息

本文报道西藏野生大麦资源的4年考察结果;叙述它们的历史发现过程、分类、分布、形态特征;确定它们属于1个种、2个亚种和48个变种,其中新变种38个,包括已报道的16个变种。西藏野生大麦具有分布地区广泛、变种多为重叠分布、变异类型多样和主要遗传性状的显性基因频率高(深色型占70%) 的特点;西藏野生二棱大麦在酯酶同功酶谱带、春冬性和小穗轴毛长短方面都有别于中东地区的以色列野生二棱大麦;考古资料证明西藏远在距今4000-5000年前已有了农事活动。这说明我国青藏高原地区是中国栽培大麦的起源地,推测是野生大麦的起源中心之一。

关键词：西藏野生大麦同功酶青藏高原地区变种小穗轴野生二棱大麦栽培大麦近缘野生大麦

NaCl胁迫下西藏野生大麦苗期耐盐生理生化机制分析

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杭州师范大学学报（自然科学版） 2017年第3期16卷 255-259页

作者：崔君金越张晓勤王嘉慧路雪丽吴玉环薛大伟杭州师范大学生命与环境科学学院浙江杭州310036

以大麦品种X41、CM72、Gairdner(Ga)为试材,采用溶液培养法,在250mmol/L NaCl胁迫下,研究了NaCl胁迫对野生大麦X41、栽培大麦CM72和Ga苗期生长及生理生化指标的影响,试图揭示西藏野生大麦X41的抗盐机制.结果表明:盐胁迫下,3种大麦的单... 详细信息

以大麦品种X41、CM72、Gairdner(Ga)为试材,采用溶液培养法,在250mmol/L NaCl胁迫下,研究了NaCl胁迫对野生大麦X41、栽培大麦CM72和Ga苗期生长及生理生化指标的影响,试图揭示西藏野生大麦X41的抗盐机制.结果表明:盐胁迫下,3种大麦的单株鲜质量、干质量和SPAD值降低;丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性增加;茎叶中Na^+含量增加,K^+含量减少;根中的Na^+、K^+含量下降;西藏野生大麦X41的单株鲜质量、干质量和SPAD值降低幅度及MDA、POD增加幅度最小,茎叶中的Na^+含量较低,表现出较强的耐盐能力.

关键词：西藏野生大麦 NaCl胁迫耐盐生理生化指标

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中国西藏近缘野生大麦5S rDNA NTS序列分析

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Acta Genetica Sinica 2005年第10期32卷 1094-1100页

作者：谭睿马得泉丁毅武汉大学生命科学学院武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室武汉430072 中国农业科学院作物科学研究所北京100081

选取来自西藏不同地理区域的17份近缘野生大麦材料和1份国外的近缘野生大麦材料,利用直接PCR、T-载体转化克隆、克隆产物测序的方法获得了它们的5S核糖体DNA NTS(Nontranscribed intergenic spacer)序列.对这些序列进行测定、分析和比较... 详细信息

选取来自西藏不同地理区域的17份近缘野生大麦材料和1份国外的近缘野生大麦材料,利用直接PCR、T-载体转化克隆、克隆产物测序的方法获得了它们的5S核糖体DNA NTS(Nontranscribed intergenic spacer)序列.对这些序列进行测定、分析和比较,构建了分子系统树.结果表明,西藏近缘野生大麦NTS序列包括两段相对保守的保守区A和保守区B以及一段变异较大的变异区V,变异区由若干个TAG碱基的重复序列构成.两段保守区总长度为168～169 bp,长度变异较小,仅相差1 bp.保守区的GC%含量为43.8%,其中有12个核甘酸位点发生变异(占总核甘酸数目的7.1%),变异位点基本上是颠换多于转换,颠换/转换率为1.0～2.0.变异区中TAG重复序列的重复次数从4到17次,而且有部分TAG重复发生了颠换和转换(TAG→TCG,TAG*→TAC).TAG重复序列的多态性是决定NTS序列多态性的主要因素.对西藏近缘野生大麦和麦属其他作物的比较,认为rDNA NTS适合作为属内分类的分子标记.

关键词：西藏野生大麦 5S核糖体DNA 非转录间隔区(NTS)

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中国西藏近缘野生大麦5S rDNANTS序列分析

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中国西藏近缘野生大麦5S rDNANTS序列分析

作者：谭睿武汉大学

学位级别：硕士

选取来自西藏不同地理区域的16份近缘野生大麦材料和1份栽培大麦以及1份国外的近缘野生大麦材料,利用直接PCR,T-载体转化克隆,克隆产物测序的方法获得了它们的5S核糖体DNA NTS（Nontranscribed intergenic spacer）序列。对这些序列进... 详细信息

选取来自西藏不同地理区域的16份近缘野生大麦材料和1份栽培大麦以及1份国外的近缘野生大麦材料,利用直接PCR,T-载体转化克隆,克隆产物测序的方法获得了它们的5S核糖体DNA NTS（Nontranscribed intergenic spacer）序列。对这些序列进行了测定、分析和比较,构建了分子系统树。研究结果表明,西藏近缘野生大麦NTS序列包括两段相对保守的保守区A和保守区B以及一段变异较大的变异区V,变异区由若干个TAG碱基的重复序列构成。两段保守区总长度为168-169bp,长度变异较小,仅相差1bp。保守区的GC%含量为43.8%,其中有12个核甘酸位点发生变异（占总核甘酸数目的7.1%）,变异位点基本上是颠换多于转换,颠换/转换率为1.0-2.0。变异区中TAG重复序列的重复次数从4到17次,而且有部分TAG重复发生了颠换和转换（TAG→TCG,TAG→TAC）。TAG重复序列的多态性是决定NTS序列多态性的主要因素。对近缘野生大麦和麦属其他作物的比较,认为rDNA NTS适合作为亚属间分类的分子标记。

关键词：西藏野生大麦 5S核糖体DNA NTS

野生大麦HvJRL34基因在低氮胁迫响应中的功能分析

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野生大麦HvJRL34基因在低氮胁迫响应中的功能分析

作者：解纯娟济南大学

学位级别：硕士

氮素是植物生长发育所必需的营养元素,目前作物增加产量的传统方法是依赖氮肥的施用。然而,氮肥的利用效率并不高,大量的使用会造成严重的环境污染和资源浪费。通过作物遗传改造培育耐低氮且高产的品种是减少氮肥使用并增加作物产量的... 详细信息

氮素是植物生长发育所必需的营养元素,目前作物增加产量的传统方法是依赖氮肥的施用。然而,氮肥的利用效率并不高,大量的使用会造成严重的环境污染和资源浪费。通过作物遗传改造培育耐低氮且高产的品种是减少氮肥使用并增加作物产量的有效途径之一。大麦作为重要的谷物作物,经过长期栽培和遗传定向改良,导致遗传基础单一,品质和抗性等方面很难有较大突破。西藏野生大麦具有适应性、抗逆性能力,是产量育种的宝贵资源。本研究拟对前期西藏野生大麦耐低氮基因型XZ149和敏感型基因型XZ56转录组分析鉴定到的一个归属于Jacalin类凝集素(JLR)家族的耐低氮候选基因进行进一步验证和初步功能分析。本研究首先在全基因组水平上,鉴定并分析了大麦中该家族成员的特性及进化关系。随后,在西藏野生大麦XZ149中克隆了该基因,对该基因结构、时空表达特征及其在拟南芥中的功能进行了分析,以期初步解析其对低氮的响应机理。本研究的主要结果如下:1.通过Hmmer search和Blastp共鉴定到35个大麦JRL家族成员,其中34个成员不均匀分布于7条染色体上。候选基因位于7号染色体上,依据染色体位置将其命名为HvJRL34。大麦JRL家族蛋白由75-1232个氨基酸残基组成,其分子量和等电点差异较大,分子量7777.89-138276.88 Da,等电点p I的范围为4.08-9.64。对大麦、小麦、拟南芥和水稻进行种间进化分析,将176个JRL蛋白分为10个亚家族。大麦JRL家族成员在基因结构、motif和结构域等方面均呈现多样性,而每个亚家族间的基因结构和基序组成基本一致。组织表达结果显示,该家族成员表达具有组织特异性。2.半定量和qPCR分析表明,该基因在根、茎和叶中均有表达,然而其表达量在根中最高。在低氮胁迫条件下,低氮耐受基因型XZ149的叶片在1 h-12 d试验时间内均上调表达,其根中持续上调表达至2 d;而低氮敏感基因型XZ56叶片中24 h后开始下调表达,根中仅在3 h和6 h上调表达。HvJRL34基因在XZ149中持续较高的表达可能有利于其较高的低氮耐性。为进一步验证,在低氮耐受基因型XZ149中成功克隆了HvJRL34基因,并构建HvJRL34:YFP过表达载体侵染烟草,制备烟草原生质体进行亚细胞定位,结果显示蛋白定位于细胞质。3.通过农杆菌介导法获得过表达HvJRL34的转基因拟南芥,并加代繁殖获得纯合的转基因拟南芥。在低氮胁迫下,野生型和转基因拟南芥根长、侧根数和鲜重均受低氮抑制,而低氮胁迫下转基因拟南芥的根长、侧根数和鲜重显著高于野生型,且其降幅均低于野生型,表明过表达HvJRL34的拟南芥具有较强的低氮耐受力。此外,低氮条件下,转基因拟南芥的硝态氮含量和可溶性蛋白含量的降幅显著低于野生型,而硝酸还原酶和谷氨酰胺合酶的活性高于野生型。这些结果表明,在低氮胁迫下,HvJRL34在拟南芥中的过表达可增强其氮素同化能力,这可能是HvJRL34增强转基因植株的低氮耐受性的一个重要原因。

关键词： HvJRL34 亚细胞定位组织表达低氮西藏野生大麦