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农业生物技术学报 2014年第6期22卷 753-761页

作者：蒋洁孙柏欣安心王铁霖李强董春玲杨玉文赵廷昌中国农业科学院植物保护研究所沈阳农业大学

细菌双精氨酸转运系统（twin-arginine translocation system,Tat）可严重影响动植物病原细菌的致病性,为了研究Tat与西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）致病性的关系,本研究通过同源重组的方法构建了西瓜嗜酸菌的tatB基因缺失菌株（Δt... 详细信息

细菌双精氨酸转运系统（twin-arginine translocation system,Tat）可严重影响动植物病原细菌的致病性,为了研究Tat与西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）致病性的关系,本研究通过同源重组的方法构建了西瓜嗜酸菌的tatB基因缺失菌株（ΔtatB）以及互补菌株（CtatB）,并从西瓜嗜酸菌致病能力、游动能力、生长能力、胞外多糖与胞外纤维素酶产生能力以及生物膜形成等方面阐明Tat系统对西瓜嗜酸菌的影响。实时荧光定量PCR探究tatB基因与Ⅲ型分泌系统相关基因（hrcN）和（hrpE）、Tat转运系统相关基因（Aave;810）和（Aave;034）以及细胞毒性相关基因（TrbC）的关系。结果表明,ΔtatB能够引起非寄主植物烟草（Nicotiana tabacum）的过敏性反应;tatB基因的缺失导致了嗜酸菌的致病力、游动能力和对数生长初期的生长能力下降;不影响西瓜嗜酸菌胞外多糖、胞外纤维素酶的产生以及生物膜的形成;导致了TrbC和hrcN基因表达量显著升高,Aave;810、Aave;034和hrpE基因的表达量显著降低。研究结果表明,Tat系统相关基因tatB的缺失会影响西瓜嗜酸菌一些生物学特性,并导致病菌致病能力降低。本研究为西瓜嗜酸菌Ⅲ型分泌系统外的其他分泌系统与致病性的关系研究提供了基础资料。

关键词：双精氨酸转运系统西瓜嗜酸菌 tatB基因

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR(4229)的功能研究

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植物病理学报 2016年第2期46卷 198-206页

作者：王铁霖杨玉文关巍赵廷昌中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株... 详细信息

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。

关键词：西瓜嗜酸菌 LuxR家族调控因子 luxR_(4229)

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西瓜嗜酸菌趋化性的初步研究

植物保护 2016年第3期42卷 161-164,189页

作者：杨姗姗孙柏欣王铁霖张晓晓杨玉文赵廷昌中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

瓜类细菌性果斑病是世界范围的检疫性细菌病害,病原菌为西瓜嗜酸菌,带菌种子为主要侵染源。病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切,而趋化性是决定定殖能力的关键因素之一,研究不同物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响对防治瓜类... 详细信息

瓜类细菌性果斑病是世界范围的检疫性细菌病害,病原菌为西瓜嗜酸菌,带菌种子为主要侵染源。病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切,而趋化性是决定定殖能力的关键因素之一,研究不同物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响对防治瓜类细菌性果斑病具有重要意义。本文采用毛细管法,研究了碳源、氨基酸、有机酸及其他物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响。结果表明,所测碳源中,麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖均显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测氨基酸中,L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测有机酸中,琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;氯化钠、硫酸镁等对西瓜嗜酸菌的趋化性无显著影响。

关键词：西瓜嗜酸菌趋化性毛细管法

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西瓜嗜酸菌pilL菌毛基因的序列分析

北方园艺 2013年第13期 121-124页

作者：林振亚高必达赵廷昌湖南农业大学生物安全科学技术学院湖南长沙410128 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

在西瓜嗜酸菌标准菌株AAC00-1全基因组序列中选取了1个菌毛基因pilL序列,利用这个基因设计引物,选取国内外比较有代表性的7株西瓜嗜酸菌菌株进行PCR扩增,并对PCR产物进行了测序,从生物信息学的角度对这7个菌株pilL基因的序列特征、同源... 详细信息

在西瓜嗜酸菌标准菌株AAC00-1全基因组序列中选取了1个菌毛基因pilL序列,利用这个基因设计引物,选取国内外比较有代表性的7株西瓜嗜酸菌菌株进行PCR扩增,并对PCR产物进行了测序,从生物信息学的角度对这7个菌株pilL基因的序列特征、同源性、分子聚类、信号肽、疏水性、跨膜结构和二级蛋白结构进行了预测分析。结果表明:Aac5、pslbtw37、W1和pslbtw22 pilL基因之间的核苷酸氨基酸特征相近,同源性高,AAC00-1、AAC203-50和Fc376之间亦如此。预测发现7个编码蛋白表现为亲水性,都无跨膜结构,Aac5、pslbtw37和W1 pilL基因都存在一个类型为SPI的信号肽,其分泌蛋白所到达的亚细胞位点为s(即分泌到周质空间)。

关键词：西瓜嗜酸菌 pilL基因生物信息学分析

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西瓜嗜酸菌分泌系统的研究进展

北方园艺 2014年第14期 196-199页

作者：安心王铁霖杨玉文唐爽爽刘志恒赵廷昌沈阳农业大学植物保护学院辽宁沈阳110161 中国农业科学院植物保护研究所北京100193

植物病原细菌多为革兰氏阴性菌。细菌的分泌系统与其致病性有密切的联系,其研究对揭示植物病原细菌的致病机理具有重要意义。现从细菌分泌系统、西瓜嗜酸菌致病机理及Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统与西瓜嗜酸菌致病性之间的关系等角度出发,重点阐... 详细信息

植物病原细菌多为革兰氏阴性菌。细菌的分泌系统与其致病性有密切的联系,其研究对揭示植物病原细菌的致病机理具有重要意义。现从细菌分泌系统、西瓜嗜酸菌致病机理及Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统与西瓜嗜酸菌致病性之间的关系等角度出发,重点阐述了与西瓜嗜酸菌分泌系统有关的功能基因,为进一步研究西瓜嗜酸菌的作用机理及寻找其致病性靶标提供理论依据。

关键词：西瓜嗜酸菌 T2SS T3SS 功能基因致病性

西瓜嗜酸菌趋化性测定及趋化基因cheA和cheY功能研究

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西瓜嗜酸菌趋化性测定及趋化基因cheA和cheY功能研究

作者：杨姗姗中国农业科学院

学位级别：硕士

瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,简称BFB)是世界范围的检疫性细菌病害,主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,造成重大的经济损失。西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli,Schaad et al,2008)是其病原菌,有研究表明病原细菌在寄主表面的... 详细信息

瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,简称BFB)是世界范围的检疫性细菌病害,主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,造成重大的经济损失。西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli,Schaad et al,2008)是其病原菌,有研究表明病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切,而病原细菌的趋化能力是决定定殖能力的关键因素之一。本研究主要围绕西瓜嗜酸菌的趋化性测定及其趋化基因的功能展开,主要结果如下:1、初步测定西瓜嗜酸菌Ac-5菌株的趋化性利用毛细管法测定碳源、氨基酸、有机酸等对西瓜嗜酸菌趋化性的影响。结果发现:麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性,而L-蛋氨酸显著抑制其趋化性;柠檬酸和苹果酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;氯化钠、硫酸镁等对西瓜嗜酸菌的趋化性无显著影响。2、Ac-5菌株趋化基因che A和che Y的生物信息学分析登录NCBI数据库西瓜嗜酸菌全基因序列查找che A和che Y基因的相关信息。che A和che Y基因分别编码Che A和Che Y蛋白。Che A和Che Y蛋白均存在多个疏水性氨基酸区域;Che A蛋白是一种跨膜蛋白,在600-700氨基酸处(即Che W结合区域)有跨膜结构,Che Y蛋白不存在跨膜结构,是一种膜内蛋白,用于接收Che A蛋白的信号;西瓜嗜酸菌Che A蛋白与青枯菌的Che A蛋白亲缘关系最近,和荧光假单胞菌的亲缘关系最远。3、Ac-5菌株趋化基因che A和che Y3的功能研究构建Δche A和Δche Y3基因缺失突变株以及Cche A互补菌株,并进行表型分析。结果发现:Δche A和Δche Y3基因缺失突变株与野生型菌Ac-5相比,趋化及运动能力下降;在种子表面的定殖能力下降;病株病情指数先下降后恢复野生型菌株Ac-5水平;生物膜形成能力增强;引起非寄主烟草的过敏性反应。4、che A基因缺失对其他基因表达量的影响利用荧光定量PCR分析che A基因缺失对其他基因表达量的影响。结果显示che A基因在突变株中不表达,T3SS中hrc N和hrp E基因,毒性蛋白trb C和vir B基因,鞭毛合成基因mot A和动力蛋白基因fli M以及信号接收蛋白基因che Y1均上调表达。

关键词：西瓜嗜酸菌趋化性 cheA基因 cheY基因致病力

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西瓜嗜酸菌鞭毛突变体的筛选及功能研究

西瓜嗜酸菌鞭毛突变体的筛选及功能研究

作者：汪超福建农林大学

学位级别：硕士

本研究利用三亲杂交技术将带有卡那霉素抗性的Tn5转座子转到果斑病菌A13和3号菌株中,分别获得菌株A13转化克隆子1036个,菌株3转化741个,共计1777个克隆子,并分别随机挑选60个进行果斑病菌和卡那基因验证,所验证的克隆子均能扩增到一条条... 详细信息

本研究利用三亲杂交技术将带有卡那霉素抗性的Tn5转座子转到果斑病菌A13和3号菌株中,分别获得菌株A13转化克隆子1036个,菌株3转化741个,共计1777个克隆子,并分别随机挑选60个进行果斑病菌和卡那基因验证,所验证的克隆子均能扩增到一条条带(果斑病菌360bp,卡那基因586bp)说明所获得克隆子均为果斑病病菌,而且均带有Tn5转座子,从而成功构建了果斑病菌菌株A13和3的突变体库。利用平板游动性检测法对获得的1777克隆子进行筛选,结果表明从1777个突变子中筛选得到45株游动性出现不同程度减弱的突变株,其中从A13突变株中筛选到游动性减弱的有30株,而明显减弱的有3株;从菌株3号克隆子中筛选到游动性减弱的菌株有15株;对这45株游动性减弱的突变株进行致病性测定,结果表明丧失致病性的菌株有5株,致病性减弱的有5株,致病性没有发生变化的菌株有35株。本研究从上述筛选结果中选出3株(菌株438、561和567)游动性显著减弱的菌株进行鞭毛的形态特征、致病性、过敏性反应、生长能力、群体感应信号、生物膜、胞外多糖等研究,结果如下： (1)电镜观察结果表明菌株438的鞭毛较野生型菌株短、菌株561的鞭毛完全丧失,而菌株567的鞭毛较野生菌株细;(2)致病性测定发现鞭毛变短和缺失的突变体(438和561)丧失了致病性,而鞭毛变细的突变体(567)致病性与野生菌株相同;(3)过敏性测定结果表明鞭毛变短和缺失的突变体不能激发烟草的过敏性反应,而鞭毛细的突变体与野生型菌株相同,可以激发明显的过敏性反应;(4)鞭毛变短和缺失的突变体都能形成群体感应信号和明显的生物膜,胞外多糖的产生方面有明显差异,而鞭毛细的突变体和野生型一样,不产生群体感应信号,也没有形成生物膜的能力;在生长能力方面鞭毛变短和缺失突变体和野生型菌株之间没有明显差异。但是鞭毛细突变体的生长比野生型菌株缓慢滞后。因此本研究表明果斑病菌的鞭毛是该病菌致病的重要因素之一。

关键词：西瓜嗜酸菌 Tn5转座子鞭毛致病性游动性群体感应

西瓜嗜酸菌双精氨酸转运系统功能基因tatB研究

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西瓜嗜酸菌双精氨酸转运系统功能基因tatB研究

作者：蒋洁中国农业科学院

学位级别：硕士

瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch, BFB)是西甜瓜上的全国检疫性病害，也是一种毁灭性病害，对西甜瓜产业造成了重大危害。其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。与多数革兰氏阴性菌一样，蛋白质分泌系统与其致病性有紧... 详细信息

瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch, BFB)是西甜瓜上的全国检疫性病害，也是一种毁灭性病害，对西甜瓜产业造成了重大危害。其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。与多数革兰氏阴性菌一样，蛋白质分泌系统与其致病性有紧密联系。在已报道的许多植物病原细菌中，双精氨酸转运系统(Twin-arginine translocation,Tat)关键基因的缺失会严重影响其致病性。目前在西瓜嗜酸菌中还没有这方面报道。本研究首先对西瓜嗜酸菌Tat途径的关键基因tatB和其他7种革兰氏阴性菌的tatB基因进行了基础生物信息学分析;然后运用同源标记置换法，获得了西瓜嗜酸菌Tat系统核心基因tatB缺失的突变体菌株——△tatB。通过比较野生型菌株和突变菌株在致病性以及与致病性相关的生物学性状之间的差异，研究tatB基因的功能。最后利用实时荧光定量法研究该基因对相关基因表达量的影响。主要获得以下结论： 1、西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息学分析登录NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库上西瓜嗜酸菌全基因组序列找到tatB基因。tatB基因大小为495bp，编码的TatB是具有164个氨基酸残基的转移酶，主要负责Sec-independent分泌途径的蛋白转运;西瓜嗜酸菌TatB蛋白与茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和洋葱酸皮病菌(Burkholderia cenocepacia)的理化性质最为相似，亲缘关系也与它们最近;预测该蛋白在10位氨基酸残基附近的疏水性较高，且该区域附近具有1个跨膜结构域;模拟该蛋白的三级结构为“L”型，与其所属超家族的蛋白核心序列三级结构一致。 2、tatB基因缺失突变体菌株和互补菌株的构建本研究在自杀性质粒载体pK18mobsacB上面成功构建了tatB基因的重组质粒，并利用三亲杂交的方法将之导入到野生型菌株中，通过同源重组双交换的方法成功获得了突变体菌株△tatB;在互补质粒pBBR1MCS-2上成功构建了互补载体，并通过电击的方法将之导入到突变体菌株中，筛选得到互补菌株CtatB. 3、tatB基因缺失突变体菌株和互补菌株的表型测定和野生型菌株相比，突变体的致病力显著降低;运动能力显著下降;在对数生长初期的生长能力显著下降，这表明tatB基因与西瓜嗜酸菌的这3种表型关系密切。tatB基因的缺失不影响西瓜嗜酸菌的致敏性反应，胞外纤维素酶活性，生物膜形成和胞外多糖的产生，说明tatB基因与西瓜嗜酸菌这的3种表型的关系无关。 4、tatB基因的缺失对相关基因表达量的影响采用实时荧光定量PCR的方法测定tatB基因对西瓜嗜酸菌中与抗铜机制以及III型分泌系统相关基因表达量的影响。结果发现：突变体中的Aave034和Aave084基因的表达量显著降低，说明tatB基因与西瓜嗜酸菌的抗铜机制有关;突变体中的Aave463基因表达量显著上升，Aave464的表达量显著下降，这表明tatB基因与西瓜嗜酸菌的III型分泌系统关系密切;突变体中的tatB基因的表达量为0，说明tatB在突变体菌株中不表达。

关键词：西瓜嗜酸菌双精氨酸转运系统 tatB

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西瓜嗜酸菌致病相关基因的筛选及功能分析

西瓜嗜酸菌致病相关基因的筛选及功能分析

作者：陈娇梅福建农林大学

学位级别：硕士

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,简称BFB),主要危害西瓜、甜瓜,引起叶斑或叶枯,造成果实腐烂,导致大量减产,严重时甚至绝收;其病原为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli),被国际规定为检疫性有害生物之一。然而,目前对此病菌致... 详细信息

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,简称BFB),主要危害西瓜、甜瓜,引起叶斑或叶枯,造成果实腐烂,导致大量减产,严重时甚至绝收;其病原为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli),被国际规定为检疫性有害生物之一。然而,目前对此病菌致病机制的探究相对来说较少,因此本研究的主要目标是找出以及克隆致病相关基因,并对其功能进行分析。从本实验室构建的西瓜嗜酸菌突变体文库中活化出1468株突变体作为出发菌,经过两轮的西瓜果实致病性测定,获得了215株致病性丧失或明显下降的突变体;对1468株突变体进行观察,发现131株突变体颜色发生了变化,160株突变体形态发生改变。在西瓜果实上致病性丧失的127株突变体中,83.5%的突变体颜色发生改变,85.8%的突变体形态发生了变化,然而致病性显著下降的88株突变体与其颜色和形态没有明显的相关性。对致病力丧失或显著减弱以及颜色和(或)形态有变化的50株突变体进行甜瓜浸种试验,从中挑出16株致病力丧失或减弱的突变体进行西瓜摩擦接种试验,筛选出11株突变体进行亚克隆,得到了9个相关基因。利用三亲杂交的方法,构建其中5个突变体的互补菌株,这些突变体被插入的基因分别为：1transcriptional regulator AraC family, HrpB;hypothetical protein;DNA-3-methyladenine glycosylase I;L-threonine aldolase;pilus retraction ATPase. PilT。将野生菌A13和3号,5株突变体(195、462、944、X484、X522)以及5株互补菌株(195hb、462hb、944hb、X484hb、X522hb)的过敏性反应、致病性、形态特征、颜色显示、生长能力、群体感应信号、生物膜等进行研究,结果发现互补菌株195hb基本恢复了过敏反应、致病能力以及生物膜形成能力;菌株944hb恢复了游动能力;菌株X522hb部分恢复了致病能力;其余互补菌株(462hb、 944hb、X484hb)致病性等表型均没有恢复,因此表明了HrpB和PUT基因是与西瓜嗜酸菌致病相关的基因。

关键词：西瓜嗜酸菌致病性亚克隆三亲杂交生物学特性