检索结果-南通市图书馆

作者：李文明郑州大学

学位级别：硕士

西布特罗(Cimbuterol,CIB),属于β-受体激动剂,与克伦特罗(Clenbuterol,CL)、莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)等都被列为非法添加物,随着对CL、RAC的严格监控,CIB可能作为替代品被非法用于动物饲养,这将给我国动物源性食品安全带来巨大威... 详细信息

西布特罗(Cimbuterol,CIB),属于β-受体激动剂,与克伦特罗(Clenbuterol,CL)、莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)等都被列为非法添加物,随着对CL、RAC的严格监控,CIB可能作为替代品被非法用于动物饲养,这将给我国动物源性食品安全带来巨大威胁。噬菌体抗体库技术是新一代抗体制备技术,具有开发周期短、操作简单、选择范围广等特点,在免疫学快速检测方面具有良好的应用前景。本研究旨在利用抗体基因工程技术和噬菌体表面展示技术构建CIB噬菌体单链抗体库,从中筛选出特异性的CIB单链抗体(Single chain antibody fragment,Sc Fv),为建立CIB的免疫学快速检测方法提供理论依据和物质基础。本研究应用重氮化法制备人工免疫抗原CIB-BSA和检测抗原CIB-OVA,并利用SDS-PAGE、紫外扫描(UV)方法进行鉴定。以CIB-BSA免疫BALB/c小鼠,提取脾细胞总RNA,反转录获得c DNA,采用PCR技术扩增获得抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将VH、VL和含有Linker接头片段连接,克隆至噬菌粒载体p CANTAB5E,电穿孔转化至大肠杆菌TG1中,经辅助噬菌体M13K07“拯救”后获得CIB噬菌体单链抗体库。然后以CIB-BSA和CIB-OVA为靶抗原,通过4轮亲和淘选、富集后,经phage-ELISA筛选出特异性的阳性噬菌粒克隆,并在表达菌株HB2151中诱导可溶性表达后,对其特异性和亲和力鉴定。结果表明,SDS-PAGE显示偶联产物的分子量相较载体蛋白明显增加;UV结果显示偶联产物的紫外最大吸收峰发生红移,表明成功制备CIB完全抗原;经免疫小鼠后成功诱导产生抗体,效价大于1:10 000以上;成功扩增出VH、VL并与Linker成功拼接形成Sc Fv片段,大小分别约为360 bp、320 bp及750 bp,克隆至p CANTAB5E转化后经鉴定其插入率约为77.27%、库容为1.5×10,辅助噬菌体“拯救”后制备的噬菌体抗体库滴度为7.6×10pfu/m L;4轮淘选后获得的特异性噬菌体相对于第1轮淘选提高了约140倍,经phage-ELISA检测结果显示,成功筛选出一株抗CIB的特异性噬菌体单链抗体株CIB-5-Sc Fv,其编码246个氨基酸,核酸序列大小为738 bp,与鼠源VH和VL的同源性为分别为92%和94%;特异性噬菌体侵染表达菌株HB2151后,经诱导后在周质腔内获得可溶性表达;生物活性分析显示该可溶性单链抗体与CIB有良好的结合活性,IC=164.197 ng/m L,除与CL交叉反应率达26.12%外,与所检测的其他β-受体激动剂无交叉反应。以上结果表明,成功筛选出具有良好特异性和亲和力的抗CIB单链抗体,为后期建立CIB免疫学快速检测方法提供了理论依据和物质基础。

关键词：西布特罗重氮化法噬菌体抗体库单链抗体

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稳定同位素标记的西布特罗-D9、马布特罗-D9的合成

稳定同位素标记的西布特罗-D9、马布特罗-D9的合成

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作者：卢浩华东理工大学

学位级别：硕士

随着我国国民经济的不断发展,人们各方面的需求也在不断提高。特别是在饮食方面,人们需要更健康更安全的食品。我国正在推进的“健康中国”战略中,食品安全是重要建设内容之一。然而,随着一些重大食品安全问题不断被爆出,食品安全已经... 详细信息

随着我国国民经济的不断发展,人们各方面的需求也在不断提高。特别是在饮食方面,人们需要更健康更安全的食品。我国正在推进的“健康中国”战略中,食品安全是重要建设内容之一。然而,随着一些重大食品安全问题不断被爆出,食品安全已经演变成“食品危机”,成为让百姓忧虑的问题。近年来出现了许多猪肉类食品中“瘦肉精”含量过高导致的毒害事件,通常所说的“瘦肉精”则是指克伦特罗。其它这样类似化合物还有莱克多巴胺、西布特罗、马布特罗等,这些都属于β受体激动剂。而我国政府自1997年连续发布了一系列的法规禁止使用β受体激动剂,确保食品的安全。β受体激动剂的检测方法中,同位素质稀释谱法的最为准确,但相关试剂基本以进口为主,售价昂贵。本课题选取氘同位素标记西布特罗和同位素标记马布特罗进行针对性制备研究。在实验过程中,课题在天然丰度β受体激动剂合成路线的基础上,结合稳定同位素标记的合成特点,设计合理的合成路线,选择合适的精制工艺,以天然丰度的基础原料进行试验摸索打通路线,再以关键性原料氘代叔丁胺的利用率为基础进行反应条件的摸索,在此基础上进行了全合成试验的重复性研究,最后进行了丰度实验,保证产品同位素丰度和化学纯度都能符合预定的同位素标记试剂的要求,开发出西布特罗-D9、马布特罗-D9合成路线,使用了薄层层析色谱、高效液相色谱、质谱、核磁共振等分析手段对中间体以及最终产品进行了表征,具体结果如下:（1）在西布特罗-D9的合成中,以叔丁胺-D9作为标记前体,从对氨基苯乙酮出发,先后经溴化、氰化,再次溴化、胺化和还原,合成得到西布特罗-D9。通过溴化试剂摸索和叔丁胺投料比的实验探索,确定当3-氰基-4-氨基-α-溴代苯乙酮与叔丁胺摩尔比为1:1.5倍量时,叔丁胺利用率最高,以消耗的叔丁胺-D9计算,产品的总收率为28%。产物经HPLC、LC-MS、NMR进行了结构表征,化学纯度98.30%,同位素丰度大于98.00 atom%D,满足同位素内标试剂产品质量要求。（2）在马布特罗-D9的合成中,采用3-氯-4-氨基-5-三氟甲基苯乙酮为起始原料,叔丁胺-D9为同位素前体,经过溴化、胺化和还原等三步反应合成同位素标记的马布特罗-D9,经过试验条件摸索,当3-氯-4-氨基-5-三氟甲基-α-溴代苯乙酮与叔丁胺摩尔比为1:1.5,反应温度70℃,反应时间2小时,以消耗的叔丁胺-D9计,马布特罗的收率为22.0%。产物经HPLC、LC-MS、NMR进行了结构表征,化学纯度为98.19%,同位素丰度大于98.00 atom%D,满足同位素内标试剂产品质量要求。

关键词：稳定同位素标记 β受体激动剂西布特罗马布特罗

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两种新型β-受体激动剂溴布特罗和西布特罗酶免疫分析法的建立

两种新型β-受体激动剂溴布特罗和西布特罗酶免疫分析法的建立

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作者：杜海菁苏州大学

学位级别：硕士

β-受体激动剂也就是人们常说的瘦肉精,这类物质具有营养再分配的作用,能有效提高动物体的瘦肉率,常被用于畜牧业生产,并通过食物链危害人们的身体健康。在畜产品中残留而引发的食物中毒事件见诸报端,中华人民共和国农业部已多次颁布公... 详细信息

β-受体激动剂也就是人们常说的瘦肉精,这类物质具有营养再分配的作用,能有效提高动物体的瘦肉率,常被用于畜牧业生产,并通过食物链危害人们的身体健康。在畜产品中残留而引发的食物中毒事件见诸报端,中华人民共和国农业部已多次颁布公告,明确提出禁止在动物饲料及其饮用水中添加β-激动剂。目前,最常使用的β-激动剂主要有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇,近几年也出现了一种新的β-激动剂苯乙醇胺A,这几种瘦肉精都已具备了相应的检测方法。然而,作为新型瘦肉精的溴布特罗和西布特罗,其结构与克伦特罗相似,但测定方法有限。为对今后可能存在的瘦肉精类食品安全问题加以防范,建立溴布特罗和西布特罗的快速测定方法很有必要。本研究考虑到溴布特罗和西布特罗的结构十分相近,苯环上都带有氨基,因而均采用重氮化法合成溴布特罗与西布特罗的包被抗原及免疫原,最终得到溴布特罗和西布特罗两种多克隆抗体,分别建立了灵敏度高、特异性强的酶联免疫吸附分析(ic-ELISAs)法,同时通过高效液相色谱(HPLC)法印证了该法测定实际样品的可行性。在最优实验条件下,基于溴布特罗抗体的ELISAs法的IC50值在0.165-0.243ng·m L-1之间,基于西布特罗抗体的ELISAs法的IC50值为0.218 ng·mL-1,表明本研究所建立的酶联免疫吸附分析法灵敏度高。同时该方法的交叉反应实验表明了其较高的特异性。本研究选择猪肉、猪肝和猪饲料这三种实际样品进行加标回收测定,考察方法的准确性和精密度,其中,测定溴布特罗的回收率为91.9–115.4%,批内变异系数(CV)为1.5–9.5%(n=3),批间CV为1.7–13.4%(n=3);测定西布特罗的回收率在95.41–114.5%,批内CV为2.2–9.3%(n=3),批间CV为2.3–12.3%(n=3)。与HPLC的测定结果相比,基于溴布特罗和西布特罗的两种ELISA方法均与HPLC有着很好的相关性。此外,针对西布特罗酶免疫分析方法,本研究还选取了基于金纳米颗粒的免疫层析试剂条作为方法对照,半定量试剂条的最低检测限在3 ng·m L-1,该灵敏度远远不如ELISA法。因此,经过实验证实,本论文建立的ELISA法是一种可靠的测定饲料及组织样品中溴布特罗和西布特罗的方法,且具有灵敏度高、特异性强的优点。

关键词：酶联免疫吸附分析法 β-受体激动剂溴布特罗西布特罗多克隆抗体食品安全

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7个β-受体激动剂的电喷雾质谱裂解规律研究

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药物分析杂志 2018年第8期38卷 1419-1426页

作者：王聪梁瑞强钮正睿曹进中国食品药品检定研究院北京100050

目的:对7个β-受体激动剂(西马特罗、西布特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、氯丙那林)的电喷雾质谱裂解规律进行研究。方法:采用电喷雾正离子化-四极杆飞行时间质谱,碰撞气为高纯氮气,干燥气温度为350℃,干燥气流速10 L... 详细信息

目的:对7个β-受体激动剂(西马特罗、西布特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、氯丙那林)的电喷雾质谱裂解规律进行研究。方法:采用电喷雾正离子化-四极杆飞行时间质谱,碰撞气为高纯氮气,干燥气温度为350℃,干燥气流速10 L·min^(-1),毛细管出口电压为125 V,对7个不同类型β-受体激动剂进行质谱分析。结果:β-受体激动剂在正离子检测模式下易发生质子化,形成[M+H]^+的准分子离子,用高分辨质谱对准分子离子进行碰撞诱导解离,形成特征碎片离子,根据精确质量数对碎片离子进行确证,分析各类β-受体激动剂的裂解规律。结论:本文提出的电喷雾质谱裂解规律可为β-受体激动剂的筛查、确证提供参考。

关键词： β-受体激动剂西马特罗西布特罗克伦特罗莱克多巴胺特布他林沙丁胺醇氯丙那林电喷雾-四极杆飞行时间质谱裂解规律

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基于吖啶酯作为柱前化学发光衍生试剂的毛细管电泳化学发光法高灵敏度检测拟交感神经药物

基于吖啶酯作为柱前化学发光衍生试剂的毛细管电泳化学发光法高灵...

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化学与创新药物——2013年中国化学会产学研合作研讨会

作者：王作荣岳欢王琳付志锋西南大学药学院发光与实时分析教育部重点实验室

毛细管电泳（CE）-化学发光（CL）联用技术是一种高效、快速、高灵敏度的新型分离检测手段,在生物样品的分离分析中已得到广泛应用。吖啶酯是一种高效的化学发光物质,具有化学发光量子产率高、发光背景低等优点。用于化学发光标记时,其... 详细信息

毛细管电泳（CE）-化学发光（CL）联用技术是一种高效、快速、高灵敏度的新型分离检测手段,在生物样品的分离分析中已得到广泛应用。吖啶酯是一种高效的化学发光物质,具有化学发光量子产率高、发光背景低等优点。用于化学发光标记时,其标记过程条件较为温和、标记物稳定性较好[1]。因此己被成功应用于蛋白质及核酸的化学发光免疫分析中[2]。此外,如图Fig.1所示,由于其闪光型动力学特点,这种发光标记物能够很好地适用于流动分析体系中。本文中利用吖啶酯作为化学发光物,标记了拟交感神经药物多巴胶及西布特岁。过氧化氢为氧化剂,Triton X-100为化学发光增强利,在碱性介质下与吖啶酯产生化学发光反应,将此化学发光反应用于毛细管电泳的柱后检测。最优条件下,标准图谱如Fig.2所示,多巴胺及西布特岁的线性范围分别为5.0.1500 ng/mL及2.0-1000 ng/mL.检测限分别为2.0 ng/mL,0.5ng/mL。将该CE-CL方法应用于人尿液中的多巴胺的检测,样品加标图谱如图Fig.3所示,所得实验结果与ELISA试剂盒检测的实验结果一致.回收率实验令人满意。该CE-CL方法灵敏度高.可应用于临床与生物医药中伯胺、仲胺类化合物的分析。

关键词：毛细管电泳化学发光多巴胺西布特罗吖啶酯

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