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弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

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应用海洋学学报 2024年第2期43卷 255-265页

作者：李慧敏邵宗泽路瑶杨江科周梅先武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北武汉430023 自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室福建厦门361005

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现... 详细信息

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明:重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5~50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5~7.5,在pH为6.0~9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg;K^(+)、Cs^(+)、Na^(+)、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主要为单糖、二糖和三糖混合物,结合底物特异性分析,推测重组酶VRALG1是具有明显聚古罗糖醛酸偏好性的内切型双功能褐藻胶裂解酶。本研究成功克隆了弧菌DS32中褐藻胶裂解酶基因并实现了其在大肠杆菌中的异源表达,所得重组酶VRALG1具有优良的海藻酸钠降解活性和明显的聚古罗糖醛酸偏好性,可以用于制备低聚合度的褐藻寡糖。

关键词：海洋生物学褐藻胶裂解酶褐藻寡糖克隆表达酶学性质聚古罗糖醛酸偏好性

微泡菌QZHA1褐藻胶裂解酶MAAL1的酶学性质研究

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应用海洋学学报 2024年第2期43卷 266-275页

作者：闫康路邵宗泽王万鹏谢珍玉周梅先海南大学海洋生物与水产学院海南海口570000 自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室福建厦门361005

为探究Microbulbifer sp.QZHA1褐藻胶裂解(Escherichia coli)酶MAAL1的酶学性质,将褐藻胶裂解酶基因maal1构建至pET-28a表达载体并利用大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。研究发现:重组酶MAAL1与来源于Microbulbifer sp.ALW1菌株的褐藻胶裂解酶(WP_23625014.1)同源性最高,为93.69%,且与PL7家族蛋白聚为一支;重组酶MAAL1最适温度为35℃,最适pH为7.5,在pH为5.5~10.5范围内保存24 h仍能保持60%以上的酶活力;MAAL1具备良好的耐有机溶剂特性,在测试的9种有机溶剂中,除异丙醇外,其他有机溶剂在添加量达到30%(体积分数)后,酶活力依然保持在59%以上;重组酶MAAL1最适条件下酶活力为4.3 U/mg,米氏常数(K_(m))值为1.08 mg/mL,最大反应速率(V_(max))为4.75 mg/(mL·min),催化常数(Kcat)值为4.52 s^(-1);重组酶MAAL1对聚β-D-甘露糖醛酸(polymannuronic acid,PolyM)具有底物特异性,对聚α-L-古罗糖醛酸(polyguluronic acid,PolyG)无降解能力;薄层层析分析显示,MAAL1降解海藻酸钠的主要终产物是单糖、二糖和三糖,降解PolyM的主要终产物是二糖和三糖,降解MG杂合片段(heteropolymeric MG blocks,PolyMG)的主要终产物为单糖和二糖,故MAAL1是一种内切型聚甘露糖醛酸裂解酶。重组酶MAAL1具有良好的pH和有机溶剂耐受性,对PolyM具有底物特异性且不降解PolyG,该特性褐藻胶裂解酶首次在微泡菌属中被发现,该酶可为制备甘露糖醛酸寡糖(mannuronate oligosaccharides,MAOS)提供新的候选用酶。

关键词：海洋生物学微泡菌属褐藻胶裂解酶克隆表达聚甘露糖醛酸耐有机溶剂

产褐藻胶裂解酶菌株S10的鉴定、全基因组测序及分析

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食品科学 2024年

作者：刘芳舒志强王共明井月欣赵云苹徐英江矫春娜张健山东省海洋资源与环境研究院烟台市海珍品质量安全控制与精深加工重点实验室上海海洋大学食品学院

菌株S10是从仿刺参肠道中分离出的一株具有较高酶活的高产褐藻胶裂解酶菌株。为了详细解析菌株S10的基因组序列信息，进而深入挖掘与褐藻胶裂解酶相关的基因资源。本研究通过形态学观察和16S rRNA序列分析对菌株S10进行了菌种鉴定，然... 详细信息

菌株S10是从仿刺参肠道中分离出的一株具有较高酶活的高产褐藻胶裂解酶菌株。为了详细解析菌株S10的基因组序列信息，进而深入挖掘与褐藻胶裂解酶相关的基因资源。本研究通过形态学观察和16S rRNA序列分析对菌株S10进行了菌种鉴定，然后利用Illumina二代测序技术和第三代高通量PacBio测序平台对菌株S10进行全基因组测序，并使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测及基因功能注释等。此外，根据注释结果对菌株S10中所含的3组假定褐藻胶裂解酶基因序列进行生物信息学分析及结构预测。结果表明，菌株S10被鉴定为Vibrio alginolyticus，基因组总长度为5 397 046 bp，GC含量为44.59%，由两条染色体和一条质粒组成。预测共有4 936个编码基因，127个tRNA基因和37个rRNA基因。在COG、GO、KEGG和CAZy数据库中分别注释到4 039、3 163、3 104和96个功能基因。此外，在菌株S10中发现了3组潜在的褐藻胶裂解酶基因alg4755、alg4756和alg4760。生物信息学分析表明，褐藻胶裂解酶Alg4755、Alg4756和Alg4760均属于多糖裂解酶家族7（PL7）蛋白，具有3个PL7家族高度保守的基序（R*E*R，Q(I/V)H，Y*KAG*Y*Q）。综上，S10菌株全基因组测序及分析对该菌的高效产酶机制研究和新型褐藻胶裂解酶的挖掘具有重要意义，也为后期酶的表达及工业化应用提供理论基础。

关键词：褐藻胶裂解酶溶藻弧菌全基因组测序基因功能注释生物信息学

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毕赤酵母表达食琼脂火色杆菌褐藻胶裂解酶

食品科技 2024年第6期 19-25页

作者：程志钱程晓峰涂红艳冯青青程功湖州检验检疫综合技术服务中心安徽农业大学动物科技学院合肥市动物疫病预防控制中心中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室

选择食琼脂火色杆菌(Flammeovirga agarivorans)的潜在褐藻胶裂解酶基因，对其进行序列优化及全基因合成，在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行分泌表达。摇瓶诱导表达产物的蛋白浓度为0.23 mg/mL。表达的褐藻胶裂解酶最适pH值为9.0，最... 详细信息

选择食琼脂火色杆菌(Flammeovirga agarivorans)的潜在褐藻胶裂解酶基因，对其进行序列优化及全基因合成，在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行分泌表达。摇瓶诱导表达产物的蛋白浓度为0.23 mg/mL。表达的褐藻胶裂解酶最适pH值为9.0，最适温度为40 ℃，在该条件下的酶活力达400.00 U/mL。该酶在40 ℃及以下时较稳定。底物特异性分析结果显示，该酶对聚甘露糖醛酸及聚古罗糖醛酸均有水解能力，但对聚古罗糖醛酸的水解能力更强。利用该酶水解褐藻酸钠并使用高效液相色谱及质谱方法对产物进行了分析，结果显示，产物主要为聚合度2～4的褐藻寡糖。研究获得的褐藻胶裂解酶可用于褐藻寡糖的酶法规模制备。

关键词：食琼脂火色杆菌褐藻胶裂解酶毕赤酵母褐藻寡糖

一种新型褐藻胶裂解酶及其截短体对酶学性质的影响

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生物加工过程 2024年第2期22卷 156-165页

作者：李辉梅王文文储建林何冰芳吴斌钦松南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211800 南京工业大学药学院江苏南京211800

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组... 详细信息

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组中克隆表达出褐藻胶裂解酶,考察酶的催化特性。结果发现:从Paenibacillus lautus A2中鉴定出的一种新颖的褐藻胶内切酶AlgC2m,含有439个氨基酸,与PL7家族的AlgL仅有38%的最高序列一致性,其N端的碳水化合物结合模块(CBM32)和C端催化域(CD)通过一个连接子连接。AlgC2m和其截短体AlgC2m-CD降解褐藻酸钠的酶活分别为331.05和82.47 U/μmol,最适温度分别为45和30℃。另外,AlgC2m-CD对聚α-L-古罗糖醛酸(polyG)具有更明显的偏好性,酶解产物除二糖和三糖外,还有聚合度更高的四糖。

关键词：褐藻胶裂解酶碳水化合物结合模块非催化结构域 Paenibacillus lautus 产物分布

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褐藻胶裂解酶AlyE2酶学性质研究

中国海洋大学学报（自然科学版） 2022年第12期52卷 44-50页

作者：郑智张红秀刘伟治律倩倩中国海洋大学海洋生命学院山东青岛266003

本研究通过重组表达,亲和层析后利用PreScission蛋白酶切除标签,纯化获得了高纯度的重组AlyE2蛋白。AlyE2对polyG表现出明显的降解偏好性,产物的聚合度(DP)为3~5。AlyE2在不同温度、pH、NaCl浓度条件下的活性分析表明,其最适温度为30℃,... 详细信息

本研究通过重组表达,亲和层析后利用PreScission蛋白酶切除标签,纯化获得了高纯度的重组AlyE2蛋白。AlyE2对polyG表现出明显的降解偏好性,产物的聚合度(DP)为3~5。AlyE2在不同温度、pH、NaCl浓度条件下的活性分析表明,其最适温度为30℃,在20℃时活性为最高活性的70%;最适pH为7.5,且在pH=7.0~9.0的弱碱性范围均保持较高的活性;AlyE2的活性和热稳定性随着NaCl浓度的增加而升高,在1.0 mol/L NaCl条件下活性最高,并且当继续提高NaCl浓度至2.0 mol/L时,AlyE2的活性几乎不受影响;同时,在1.0~2.0 mol/L NaCl条件下AlyE2的T_(m)提高8~14℃。

关键词：褐藻胶裂解酶 PL7家族 polyG特性 NaCl浓度热稳定性

N端非催化结构域对微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响

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食品科学 2023年第16期44卷 169-176页

作者：黄小艺李鹤宾陈艳红姜泽东倪辉李清彪朱艳冰集美大学海洋食品与生物工程学院福建厦门361021 厦门医学院药学系福建厦门361023 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

为了明确非催化结构域碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响,构建并表征了全长酶AlgL7和两个截短酶CD1(催化结构域)和CD2(包含F5/8 C型结构域和催化结构域)。结果表... 详细信息

为了明确非催化结构域碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响,构建并表征了全长酶AlgL7和两个截短酶CD1(催化结构域)和CD2(包含F5/8 C型结构域和催化结构域)。结果表明,与全长AlgL7相比,截短酶CD2表现出更高的比活力、热稳定性和K_(m)值,以及更高的最大反应速率(V_(max)值),表明CBM结构域在保持酶与底物的亲和力方面具有重要作用,但降低了酶的催化活性、热稳定性和V_(max)值。与截短酶CD1相比,CD2表现出更高的比活力、最适反应温度、热稳定性、最大反应速率和Km值,表明F5/8 C型结构域有利于提高酶的催化活性、最适反应温度、热稳定性和最大反应速率,但降低了酶与底物的亲和力。以海藻酸钠为底物,截短酶CD2的比活力为183.9 U/mg,最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和7.0,K_(m)值和V_(max)值分别为39.80 mg/mL和2000 U/mg,酶解产物主要为褐藻胶寡糖二糖和三糖。本研究促进了非催化结构域与褐藻胶裂解酶性质的构效关系研究,为利用非催化结构域改善褐藻胶裂解酶的催化性质提供了一定理论基础。

关键词：褐藻胶裂解酶碳水化合物结合模块 F5/8 C型结构域酶学性质酶解产物

褐藻胶裂解酶的菌株筛选、酶学性质分析及异源表达

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褐藻胶裂解酶的菌株筛选、酶学性质分析及异源表达

作者：栾明鉴齐鲁工业大学

学位级别：硕士

由于资源枯竭问题的日益严重,大型藻类和微藻类作为生产生物燃料的可再生和环保原料而受到越来越多的研究人员的关注。褐藻胶在海藻工业中产量最大、品种最多、用途最广,被广泛应用于各行业实践中。褐藻胶的降解产物---褐藻胶寡糖也具... 详细信息

由于资源枯竭问题的日益严重,大型藻类和微藻类作为生产生物燃料的可再生和环保原料而受到越来越多的研究人员的关注。褐藻胶在海藻工业中产量最大、品种最多、用途最广,被广泛应用于各行业实践中。褐藻胶的降解产物---褐藻胶寡糖也具有诸多生物活性,近几年受到许多科研工作者的关注。由于褐藻胶寡糖的制备目前仍是研究的重点,制备方法中,生物酶解法最为高效,但与其相关的褐藻胶裂解酶,因活性低,不能工业化生产等缺点,是目前科研研究的重点难点。本文从前期分离的6株可降解海带的菌株中,筛选到褐藻胶裂解酶活性最高的菌株1e,并对1e进行了菌种鉴定、培养条件优化及褐藻胶裂解酶活性分析。随后,从1e菌种中克隆出3条不同的褐藻胶裂解酶基因,使用生物学软件分析了这三条基因的蛋白序列特点。最后,将基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母进行异源表达,分析比较了这些过表达工程菌的产酶条件,为下一步工业化生产褐藻胶裂解酶提供理论和实践基础。本研究主要研究结果如下:1.褐藻胶裂解酶高活性菌株的筛选、鉴定及酶活特性分析。本研究对前期分离的6株可分解海带的菌株进行了褐藻胶裂解酶酶活的测定,筛选得到了一株褐藻胶裂解酶酶活最高的菌株,命名为1e,酶活可达236 U/mg-protein,其活性远高于其他菌株且该酶为胞外酶。经过16S r DNA细菌鉴定,1e属于微小杆菌属(Exiguobacterium),革兰氏染色为阳性菌。对其进行生长条件优化,发现该菌种在1.0%Na Cl浓度的LB培养基中28℃,180 rpm震荡培养,生长状况较好。使用1e菌株的发酵液上清对褐藻胶裂解酶酶活特性进行分析,发现酶活的最适温度为40℃,最适p H 6.0,在该条件下测定的酶活为399.3 U/mg-protein,与未优化前的酶活相比提高1.7倍。2.微小杆菌的全基因组测序和褐藻胶裂解酶基因克隆。提取1e菌的基因组DNA,进行全基因组测序,通过注释获得3条不同的褐藻胶裂解酶基因序列信息,根据编号分别命名为Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665。在Gene Bank中通过BLAST分析发现,1e与菌株Exiguobacterium sp.PBE(NCBI序列号:CP065134.1)同源性高达99.94%;这三条褐藻胶裂解酶基因的核酸序列与Exiguobacterium sp.HVEsp1中相应的褐藻胶裂解酶基因序列同源性极高,相似性分别高达99.42%、98.85%、97.97%。3.大肠杆菌Ebalg过表达工程菌构建及产酶分析。分别设计Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665基因的上下游引物,以微小杆菌基因组DNA为模板,成功扩增出这三条褐藻胶裂解酶基因。利用同源重组技术将这三种目的基因插入大肠杆菌表达载体p ET-30a,并转化宿主菌BL21(DE3),经测序验证,最终筛选出Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665三种过表达工程菌。分别对这些工程菌的产酶条件进行确定,结果显示,三种Ebalg过表达工程菌在37℃,200 rpm震荡培养至OD值为0.6时,加入IPTG进行Ebalg表达诱导,并在16℃,继续200 rpm震荡培养22 h,能产生相应的重组蛋白。然而这三种工程菌产生的重组蛋白在在宿主菌中折叠异常,多数重组蛋白形成无活性的不溶性包涵体,少数以有活性的可溶性形式存在。对三种重组蛋白进行酶活的测定后,发现Ebalg664基因产重组蛋白的酶活性较高,故选择Ebalg664基因进行下一步毕赤酵母工程菌的构建。4.毕赤酵母Ebalg过表达工程菌构建及产酶分析。经过密码子优化,构建了p PICZa A-Ebalg664毕赤酵母高效表达质粒,通过电转将线性化质粒p PICZa A-Ebalg664插入毕赤酵母X33基因组中,并经甲醇诱导表达重组蛋白。我们对构建的毕赤酵母工程菌进行产酶测定。结果显示,Ebalg664能在宿主菌中正常转录,而且重组蛋白在发酵液上清中含量较高,重组酶的酶活高达8840 U/m L,单位酶活可达1306.5 U/mg-protein,说明Ebalg664不仅在毕赤酵母中正常转录,而且合成的重组蛋白能分泌到胞外,并保持正常酶活。对毕赤酵母工程菌中的重组酶进行酶学性质的分析,发现重组酶在30℃-50℃及p H 3.0-7.0条件下,酶活相对稳定,最适反应温度为40℃,最适p H为6.0;不同离子对重组酶酶活的影响较大,Cu、Co对Alg664的酶活性有促进作用而Mg、Fe则有明显的抑制作用;另外,EDTA对重组酶的酶活并无显著的增强或减弱作用。综上,从腐烂海带中分离的微小杆菌具有较高的褐藻胶裂解酶活性,而且基因组中含有三条褐藻胶裂解酶基因。重组褐藻胶裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中均可表达,但在大肠杆菌宿主菌中主要以不溶性包涵体形式存在,活性很低。然而在毕赤酵母中基因Ebalg664表达正常,并能向胞外分泌活性较高的重组褐藻胶裂解酶,以方便后

关键词：褐藻胶裂解酶深海微小杆菌酶学性质异源表达

嗜盐白蚁菌褐藻胶裂解酶的重组表达与改造优化

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食品与发酵工业 2023年第2期49卷 47-53页

作者：吴雯朱风帅俞嘉乐李恒龚劲松许正宏史劲松糖化学与生物技术教育部重点实验室江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江南大学江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

为进一步拓展褐藻胶裂解酶在枯草芽孢杆菌体系中的高效表达,该研究以来源于海洋嗜盐白蚁菌WX(Isoptericola halotolerans WX)的一段褐藻胶裂解酶基因aly-ih为目的片段,成功构建Bacillus subtilis-pMA5-aly-ih工程菌,并利用启动子改造与... 详细信息

为进一步拓展褐藻胶裂解酶在枯草芽孢杆菌体系中的高效表达,该研究以来源于海洋嗜盐白蚁菌WX(Isoptericola halotolerans WX)的一段褐藻胶裂解酶基因aly-ih为目的片段,成功构建Bacillus subtilis-pMA5-aly-ih工程菌,并利用启动子改造与培养基优化的方法提高酶催化活性。采用同源重组方法,将内源性启动子HpaⅡ替换为mpr,Aly-IH酶活力较初始酶活力提高至4倍;进一步通过启动子的串联多拷贝提高酶活力,当拷贝数为3时,重组酶酶活力较初始酶活力提高至5.1倍。在此基础上,优化发酵培养基配方,在16 g/L甘油、16 g/L大豆蛋白胨、25 mmol/L Mn^(2+)的培养条件下,Aly-IH酶活力提高到320 U/mL,是初始酶活力的10.7倍。该酶可高效降解褐藻胶得到平均聚合度为2.3的寡糖产物。研究结果表明,经枯草芽孢杆菌表达并改造优化的褐藻胶裂解酶Aly-IH具有良好的催化性能和应用潜力。

关键词：褐藻胶裂解酶枯草芽孢杆菌启动子改造培养基优化