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重组卵形疟原虫裂殖子表面蛋白1 N端的抗原性及免疫原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2021年第6期39卷 746-752页

作者：于嘉利刘蕾杨博楚瑞林孙毅凡刘耀宝程洋江南大学无锡医学院病原感染与免疫研究室无锡214000 江阴市第三人民医院无锡214000 上海市疾病预防控制中心上海200336 江苏省血吸虫病防治研究所无锡214000

目的表达卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(*** wallikeri)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)N端重组蛋白,并进行抗原性及免疫原性分析,以探究其作为卵形疟候选疫苗的潜力。方法PCR扩增卵形疟... 详细信息

目的表达卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(*** wallikeri)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)N端重组蛋白,并进行抗原性及免疫原性分析,以探究其作为卵形疟候选疫苗的潜力。方法PCR扩增卵形疟原虫基因组DNA Pomsp1 N端基因。将纯化后的Pocmsp1 N端、Powmsp1 N端分别与pET30a、pET32a载体连接,并转化至DH5α感受态细胞中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切验证且测序无误后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS中。0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测蛋白表达情况。15只BALB/c小鼠随机分为r Poc MSP1 N端组、r Pow MSP1 N端组和阴性对照组,每组5只,分别腹腔注射50μg与弗氏完全佐剂混合的r Poc MSP1和r Pow MSP1 N端蛋白和等量的PBS,初次免疫后第21天和第42天使用弗氏不完全佐剂加强免疫,初次免疫后第0、7、28和49天采集小鼠尾静脉血,制备血清。ELISA、Western blotting检测小鼠血清中特异性IgG、分析抗体滴度及抗体亲和指数,评估纯化后的r Poc MSP1和r Pow MSP1 N端蛋白的免疫原性。Western blotting检测r Poc MSP1和r Pow MSP1 N端蛋白的交叉反应,并用蛋白芯片分析重组蛋白在卵形疟原虫感染者血清中的抗原反应性。采用GraphPad Prism 5.0软件和Microsoft Excel 2016软件进行统计学分析,组间差异比较采用成组t检验。结果PCR扩增结果显示,Pocmsp1 N端和Powmsp1 N端片段大小均为1068 bp,与预期大小一致。PCR产物经克隆、诱导并纯化后,所获r Poc MSP1和r Pow MSP1 N端蛋白浓度分别为0.5 mg/ml和1.0 mg/ml。SDS-PAGE结果显示,r Poc MSP1和r Pow MSP1 N端的相对分子质量(Mr)分别约为46000和59000,Western blotting结果证实蛋白成功表达。免疫组小鼠血清均可特异性识别相应抗原。ELISA结果显示,在免疫后第7天检测到特异性IgG抗体,纯化的r Poc MSP1 N端蛋白和r Pow MSP1 N端蛋白均与IgG发生特异性反应,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(t=5.824、25.98,P蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.043±0.390和1.923±1.373;IgG抗体水平持续上升至免疫后第49天,r Poc MSP1 N端和r Pow MSP1 N端蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.217±0.365和2.463±0.983。r Po MSP1 N端在小鼠体内中诱导了较高的抗体应答,抗体滴度为1∶640000至1∶1280000。ELISA结果表明,用r Po MSP1 N端蛋白免疫的小鼠均诱导出高亲和力的IgG抗体,r Poc MSP1 N端和r Pow MSP1 N端免疫小鼠血清抗体亲和指数分别为97.11%和75.72%。Western blotting结果显示,r Poc MSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别r Pow MSP1 N端蛋白,r Pow MSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别r Poc MSP1 N端蛋白,两者存在交叉反应。蛋白芯片分析结果显示,r Poc MSP1 N端蛋白识别卵形疟原虫感染者血清的敏感性为83.33%、特异性为57.14%,r Pow MSP1 N端识别感染者血清的敏感性为97.62%、特异性为54.76%。r Poc MSP1 N端、r Pow MSP1 N端均与卵形疟原虫感染者血清有反应,与健康人血清相比,差异具有统计学意义(t=5.896、10.42,P蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生体液免疫应答,与卵形疟原虫感染者血清抗体反应上具有良好的抗原性。

关键词：卵形疟原虫裂殖子表面蛋白1 免疫原性抗原性

非洲输入性恶性疟病例裂殖子表面蛋白1等位基因型检测

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第4期33卷 247-250页

作者：周水茂杨燕吴凯陈智徐明星贾西帅武汉市疾病预防控制中心武汉430015

目的了解输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)等位基因型特征。方法采集非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,采用巢式PCR方法,用恶性疟原虫MSP1基因特异引物扩增疟原虫虫株MSP1基因第2区与第3区部分片段,并对MSP1等位基因... 详细信息

目的了解输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)等位基因型特征。方法采集非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,采用巢式PCR方法,用恶性疟原虫MSP1基因特异引物扩增疟原虫虫株MSP1基因第2区与第3区部分片段,并对MSP1等位基因型进行分析。结果 135例输入性恶性疟患者中检出MSP1等位基因117例,检出率为86.7%。117例扩增阳性的患者中,MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33和MAD20+K1+RO33型的检出率分别为6.0%(7/117)、36.8%(43/117)、20.5%(24/117)、6.8%(8/117)、3.4%(4/117)、17.1%(20/117)和9.4%(11/117),其中混合型感染占36.8%(43/135),MSP1等位基因多重感染平均数(MOI)为1.46。MAD20型、K1型和RO33型恶性疟患者中重症患者比例差异无统计学意义(P>0.05);74例单一型和43例混合型感染者中重症患者比例分别为25.7%(19/74)和32.6%(14/43),2种感染者回国前在国外停留的平均天数分别为(241±176)d和(285±216)d,两者间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论非洲输入性恶性疟患者感染的疟原虫MSP1基因的3种基因型和4种混合型均存在,以K1型和RO33型为优势基因型。

关键词：恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 等位基因型输入性病例

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第4期26卷 263-267页

作者：陈勤梁婉琪钱炳俊申慧峰曹建平徐馀信张大兵汤林华中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025 上海交通大学上海交通大学-中国科学院上海生命科学研究院-美国宾州州立大学生命科学联合研究中心上海200240 上海交通大学农业与生物学院上海200240

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-4... 详细信息

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选(叶片切碎、在含500mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株)3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。结果构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10d后黄化或白化,再经约30d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900bp与500bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。结论获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。

关键词：恶性疟原虫叶绿体基因表达裂殖子表面蛋白1 植物疫苗

云南省输入性及本地感染间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因5区序列的多态性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第1期35卷 1-7页

作者：董莹孙艾明陈梦妮徐艳春毛祥华邓艳云南省寄生虫病防治所云南省疟疾研究中心云南省虫媒传染病防控研究重点实验室普洱665000 大理大学基础医学院大理671000

目的分析云南省输入性及本地感染间日疟病例的疟原虫裂殖子表面蛋白1(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1,Pv MSP-1)基因5区序列及其等位基因的多态性。方法 2012年8月-2015年9月,收集云南省输入性及本地感染间日疟病例的滤... 详细信息

目的分析云南省输入性及本地感染间日疟病例的疟原虫裂殖子表面蛋白1(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1,Pv MSP-1)基因5区序列及其等位基因的多态性。方法 2012年8月-2015年9月,收集云南省输入性及本地感染间日疟病例的滤纸血样和流行病学史等相关信息。提取疟原虫DNA,PCR扩增Pv MSP-1基因5区并测序,与M75674、AAN86237、M60807、ABJ53045、AAN86238、BAA18977等参比序列进行比对,用Mega 5.04、Arlequin3.5.1软件分析Pv MSP-1基因5区的序列多态性,计算序列间保守位点、遗传距离和多样性指数,并根据氨基酸序列间的遗传距离绘制聚类树状图。结果 2012年8月-2015年9月,共收集间日疟病例血样847份。其中,云南省本地感染61份,非洲、缅甸感染的分别为66和720份。847份血样中278份扩增出Pv MSP-1基因5区片段,206份测序成功。Pv MSP-1基因5区片段编码氨基酸长193~222 aa。氨基酸序列比对分析显示,Sal-1、Belem和Recombine基因型分别占59.2%(122/206)、23.3%(48/206)和17.5%(36/206),缅甸、非洲感染和云南本地感染血样中Sal-1基因型分别占58.8%(104/177)、11/15和7/14。Sal-1、Belem、Recombine基因型分别有51、9和6个亚型。这66个亚型的Shannon-wiener指数(H’)和期望杂合度(He)分别为0.955和0.567。206条DNA序列的同源位点为665 bp、保守位点为11.3%(75/665)、变异位点为88.7%(590/665),不同感染来源地的分离株与不同的氨基酸参比序列的遗传距离均小于0.4。聚类分析显示,206条Pv MSP-1基因5区氨基酸序列按基因型聚类成2个大类,有3个次级分支,其中,Recombine与Belem基因型的相似度为91%~92%,高于与Sal-1基因型的82%~83%。结论云南省输入性及本地感染的间日疟原虫分离株Pv MSP-1基因5区存在多种亚型,在Sal-1、Belem、Recombine等3种基因型中,Sal-1型占优势。

关键词：间日疟原虫裂殖子表面蛋白1 多态性

武汉市输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1、2基因分型研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第5期35卷 434-438,444页

作者：贾西帅周水茂杨燕徐明星吴凯武汉市疾病预防控制中心武汉430015

目的了解武汉市输入性恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)和MSP2的等位基因型特征。方法于2010-2015年采集武汉市从非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,收集患者流行病学资... 详细信息

目的了解武汉市输入性恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)和MSP2的等位基因型特征。方法于2010-2015年采集武汉市从非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,收集患者流行病学资料。提取患者血样中的恶性疟原虫DNA,采用巢式PCR分别扩增恶性疟原虫MSP1、MSP2基因型特异性片段,分析各等位基因型的构成比和不同感染来源地患者的基因型频数分布,分析重症患者不同基因型的相关性。不同基因型的重症患者比例差异采用χ~2检验。结果共采集输入性恶性疟患者血样175份,其中轻度症状患者血样137份,重症患者血样38份。巢式PCR结果显示,MSP1等位基因K1、RO33、MAD20型分别扩增出260~390、270和150 bp目的条带;MSP2等位基因3D7、FC27型分别扩增出200~330、330~500 bp目的条带。MSP1和MSP2基因均未检出的有9份。检出MSP1等位基因136份,检出率为77.7%,等位基因MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33、MAD20+K1+RO33型的构成比分别为5.1%(7/136)、37.5%(51/136)、20.6%(28/136)、5.9%(8/136)、4.4%(6/136)、16.9%(23/136)、9.5%(13/136)。检出MSP2等位基因143份,检出率为81.7%,FC27、3D7和FC27+3D7型的构成比为20.2%(29/143)、39.9%(57/143)、39.9%(57/143)。MAD20型和K1以南非最多,分别占10.5%(4/38)和34.2%(13/38);RO33型以东非最多,占2/7;FC27型东非和北非均未检出,南非占比最高,为18.4%(7/38);3D7型以东非最多,占4/7。MSP1基因MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33、MAD20+K1+RO33型的重症患者分别占1/7、19.6%(10/51)、32.1%(9/28)、1/8、4/6、13.0%(3/23)、46.2%(6/13),MAD20+RO33、MAD20+K1+RO33和RO33(P>0.05),与其他4种基因型间差异有统计学意义(P19.3%(11/57)、20.7%(6/29)、24.6%(14/57),各基因型间差异无统计学意义(P>0.05)。结论武汉市输入性恶性疟原虫MSP1存在MAD20、Kl和R033等3种单基因型以及4种多基因型,以K1型和R033型为优势基因型;MSP2存在FC27、3D7和FC27+3D7型,3D7型的比例大于FC27型。

关键词：恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 裂殖子表面蛋白2 基因分型

恶性疟混合感染及裂殖子表面蛋白1和2的研究进展

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中华传染病杂志 2013年第8期31卷 510-512页

作者：陈柯璇杨照青昆明医科大学寄生虫学教研室 650500

在疟疾的高流行区，其发病率高，疟原虫的种群呈高度多样性；而在低流行区，其发病率低，疟原虫的种群多样性低。裂殖子表面蛋白1（merozotite surface protein 1，Msp-1）和裂殖子表面蛋白2（merozotite surface protein2，Msp-2）的... 详细信息

在疟疾的高流行区，其发病率高，疟原虫的种群呈高度多样性；而在低流行区，其发病率低，疟原虫的种群多样性低。裂殖子表面蛋白1（merozotite surface protein 1，Msp-1）和裂殖子表面蛋白2（merozotite surface protein2，Msp-2）的基因已被确定具有广泛的遗传多态性，并且导致各种抗原的多样性，因此，常用于作为判断疟原虫虫株的单株或者混合株感染、追踪疟原虫来源、判断基因流动的重要基因标志[1-5]。

关键词：裂殖子表面蛋白1 混合感染恶性疟 protein 基因标志遗传多态性疟原虫多样性

我国华南间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因分型和序列分析

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中国人兽共患病杂志 2002年第2期18卷 57-60页

作者：江钢锋李娟兰吴少廷王善青广东药学院寄生虫学教研室广州510224 深圳市卫生防疫站分子生物学研究室海南省热带病防治研究所

目的　了解我国间日疟原虫MSP1(PvMSP1)的等位基因类型和序列的多态性。方法　用特异的引物通过套式PCR方法体外扩增包含PvMSP1的ICB5与ICB6之间的基因片段 ,并对部分扩增产物进行序列测定和分析。结果　 2 7份间日疟原虫患者血样中 ,有... 详细信息

目的　了解我国间日疟原虫MSP1(PvMSP1)的等位基因类型和序列的多态性。方法　用特异的引物通过套式PCR方法体外扩增包含PvMSP1的ICB5与ICB6之间的基因片段 ,并对部分扩增产物进行序列测定和分析。结果　 2 7份间日疟原虫患者血样中 ,有 16份 (5 9 9% )扩增得到Belem型基因产物 ,2 5 (92 6 % )份扩增出Sal- 1型基因产物 ;两种不同等位基因型虫株的混合感染率为 5 1 9%。序列分析结果发现一个以前未见报告的基因内重组类型。结论　我国间日疟原虫虫株存在两种PvMSP1等位基因型 ,Sal- 1型可能是主导型 ;

关键词：间日疟原虫裂殖子表面蛋白1 基因分型序列分析中国

我国不同疟区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究

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中国人兽共患病杂志 2004年第1期20卷 26-30页

作者：张山鹰陆惠民许龙善高琪沈毓祖黄伟达福建省寄生虫病防治研究所福州350001 苏州大学医学院病原生物学教研室江苏省寄生虫病防治研究所安徽省疾病预防控制中心复旦大学生命科学学院

目的　了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白 - 1基因多态性及其分布。方法　用套式PCR扩增间日疟原虫现场分离株MSP - 1第五多态区 (ICB5 -ICB6 )基因片段 ,部分样本进行序列测定、分析和比对。结果　 82份间日疟原虫现场... 详细信息

目的　了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白 - 1基因多态性及其分布。方法　用套式PCR扩增间日疟原虫现场分离株MSP - 1第五多态区 (ICB5 -ICB6 )基因片段 ,部分样本进行序列测定、分析和比对。结果　 82份间日疟原虫现场分离株扩增出 4 70bp片段 5 0份 ,4 0 0bp片段 39份 ,其中 7份为两种片段的混合型。海南分离株混合型为 2 0 %(6 / 30 ) ,平均克隆数为 1 2 0 (36 / 30 ) ,安徽分离株混合型仅为 2 3% ,平均克隆数 1 0 2。对 33份样本进行序列测定 ,Sal- 1型17份 ,Belem型 2份 ,12份重组型 (Ⅲ型 )和朝鲜型 2份为我国新发现基因型。结论　我国间日疟原虫PvMSP - 1存在 4种不同的等位基因型 ,以Sal- 1型和重组型 (Ⅲ型 )占优势 ,南部疟区基因型比北部复杂。

关键词：间日疟原虫裂殖子表面蛋白1 基因多态性序列分析

辽宁丹东间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因型分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第3期30卷 242-244页

作者：耿英芝毛玲玲腾聪安春丽王博陈静乙姚文清辽宁省疾病预防控制中心沈阳110005 中国医科大学沈阳110001

用套式PCR方法扩增辽宁丹东地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)基因ICB5-ICB6片段,经PvuⅡ酶切和琼脂糖凝胶电泳,对产物进行序列分析。结果显示,11份镜检确诊的间日疟患者血液标本经套式PCR扩增均出现大小约为470 bp(Sal-1型)或400 b... 详细信息

用套式PCR方法扩增辽宁丹东地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)基因ICB5-ICB6片段,经PvuⅡ酶切和琼脂糖凝胶电泳,对产物进行序列分析。结果显示,11份镜检确诊的间日疟患者血液标本经套式PCR扩增均出现大小约为470 bp(Sal-1型)或400 bp(Belem型)的特异性片段。经PvuⅡ内切酶消化后,其中5份血样(470 bp),出现120和350 bp酶切片段,为Sal-1型;其余6份血样(400 bp)中,1份出现400 bp片段,为Belem型,1份出现120和280 bp两种酶切片段,为重组Ⅲ型,4份出现120和240 bp两种酶切片段,为朝鲜型。辽宁省丹东地区的间日疟原虫PvMSP-1基因存在3种不同的等位基因型,以Sal-1型和朝鲜型为主,但无不同等位基因型的混合感染。

关键词：间日疟原虫裂殖子表面蛋白1 等位基因序列分析