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特异性铅结合蛋白表面展示工程菌的构建及其性能研究

特异性铅结合蛋白表面展示工程菌的构建及其性能研究

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作者：李莹天津大学

学位级别：硕士

近年来,细胞表面展示技术已成为重金属修复领域的研究重点。在此背景下,本研究选取冰晶核蛋白的N端序列(INPN)为细胞外膜的锚定蛋白,首先在大肠杆菌中构建了一系列绿色荧光蛋白表面展示验证载体,考察了INPN的转运和锚定能力,并初步探究... 详细信息

近年来,细胞表面展示技术已成为重金属修复领域的研究重点。在此背景下,本研究选取冰晶核蛋白的N端序列(INPN)为细胞外膜的锚定蛋白,首先在大肠杆菌中构建了一系列绿色荧光蛋白表面展示验证载体,考察了INPN的转运和锚定能力,并初步探究了融合模式与蛋白诱导温度对蛋白表达的影响。结果表明,INPN能够在大肠杆菌中发挥其运转载体的功效,且工程菌荧光表达情况受融合方式的影响较大,不合适的连接肽可能导致融合蛋白无法正常折叠而失活;对诱导温度的研究发现,工程菌在22℃诱导下的荧光值相对较高且更稳定。基于上述工作,通过相同的融合蛋白构建方式,将来自耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans CH34)中与铅离子调控有关的两个转录调节因子PbrR和PbrR691以及铅封存蛋白PbrD锚定在大肠杆菌上,并通过细胞分级分离、蛋白印迹分析和全细胞免疫荧光印迹分析证实了融合蛋白在细胞外膜的具体定位。基于构建的若干株铅结合蛋白表面展示菌株,考察了融合方式、诱导剂浓度控制下的蛋白表达水平,以及铅离子浓度和混合金属浓度对工程菌铅离子吸附性能的影响。发现最有利于融合蛋白Pb吸附的最佳融合方式为柔性连接肽(Flexible linker),最佳的IPTG诱导浓度为0.5 m M,且菌株吸附能力随Pb浓度的增加表现出先提高后降低的态势,在500-1000μM时吸附能力达到最大化。特异性实验表明,PbrR、PbrR691和PbrD表面展示工程菌对Pb的吸附性能达到Cd的5倍以上和Hg的12倍以上;对Pb的最大吸附量分别达到942.1、754.3和864.8μmol/g CDW,这也是迄今报道的三种蛋白对铅的最高吸附量。为了检测本研究构建的工程菌的实际应用效果,建立了一种基于本氏烟草植物的生物检定法。本研究中构建的PbrR,PbrR691和PbrD表面展示工程菌处理下的烟草种子萌芽率分别为对照组的2.5,2.7和2.4倍,平均芽长分别达到对照组的8.5,7.9和9倍;土壤解毒试验中,三种工程菌处理下的植物总生物量分别达到对照组的7.45,13.35和7.3倍,说明工程菌解毒效果明显。总的来说,本研究设计并构建的PbrR,PbrR691和PbrD表面展示工程菌对Pb具有较高的吸附能力和良好的选择特异性,具有很好的应用价值,为重金属污染环境的原位修复提供了基础和依据。

关键词：铅结合蛋白表面展示工程菌特异性本氏烟草

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