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人类TAP1基因克隆及表达载体的构建

细胞与分子免疫学杂志 2004年第1期20卷 53-54页

作者：刘玉李殿俊吕雪莹杨秋霞谷金宇王兰哈尔滨医科大学免疫学教研室黑龙江哈尔滨150086 哈尔滨医科大学附属二院普外科黑龙江哈尔滨150086

抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族B亚家族.人类TAP基因位于6号染色体上的MHC-II类基因区, 其编码的TAP1和TAP2分子, 分别由748和686个氨基酸残基所组成, 两者可形成异源二聚体参与肽类的转运过程, 在M... 详细信息

抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族B亚家族.人类TAP基因位于6号染色体上的MHC-II类基因区, 其编码的TAP1和TAP2分子, 分别由748和686个氨基酸残基所组成, 两者可形成异源二聚体参与肽类的转运过程, 在MHC-I类分子介导的抗原递呈途径中起着重要作用[1, 2].因此, TAP的异常将严重影响抗原递呈, 成为病毒感染及肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制[3], 如卵巢癌 [4]、肝癌[5]及宫颈癌[6]细胞中TAP1的表达量明显下降.我们在本实验中, 从B淋巴母细胞系中克隆出TAP1基因, 并构建了其表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1.

关键词： TAP1 基因克隆表达载体的构建序列分析

猪圆环病毒2型cap基因与猪γ-干扰素基因双表达载体的构建及稳定表达

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畜牧与兽医 2010年第12期42卷 67-72页

作者：娄忠子杨彬兰喜李学瑞李志勇殷相平李宝玉柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046

通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表... 详细信息

通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin^(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin^(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。

关键词：猪圆环病毒病 cap 干扰素基因表达载体的构建 BHK-21细胞重组真核表达载体间接免疫荧光 Cap 双表达载体基因亚克隆核衣壳蛋白质粒转染阳性细胞抗性筛选克隆载体高效表达 PCR方法 Western 细胞系

雪花莲凝集素基因韧皮部表达载体的构建及其在转基因烟草中的表达

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云南大学学报（自然科学版） 1999年第S3期21卷 125-126页

作者：郭三堆李学勇中国农业科学院生物技术研究中心北京100081

蝴蝶兰ACC合成酶（ACS）反义基因植物表达载体的构建及遗传转化

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蝴蝶兰ACC合成酶（ACS）反义基因植物表达载体的构建及遗传转化

作者：牛苏燕河南农业大学

学位级别：硕士

本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrid）为研究对象，克隆获得蝴蝶兰ACC合成酶的基因片段，构建了反义基因的植物表达载体。采用根癌农杆菌介导法，将ACC合成酶反义基因导入蝴蝶兰，并对蝴蝶兰的转化植株进行GUS组织化学染色检验和筛选... 详细信息

本研究以蝴蝶兰（Phalaenopsis hybrid）为研究对象，克隆获得蝴蝶兰ACC合成酶的基因片段，构建了反义基因的植物表达载体。采用根癌农杆菌介导法，将ACC合成酶反义基因导入蝴蝶兰，并对蝴蝶兰的转化植株进行GUS组织化学染色检验和筛选，还对蝴蝶兰的转化植株进行了PCR分子检验。主要研究结果如下：（1）蝴蝶兰ACC合成酶基因的克隆与序列分析根据NCBI中已报道的蝴蝶兰ACC合成酶基因序列设计引物，从蝴蝶兰总RNA中克隆出ACS保守区的461bp片段，连接至克隆载体pMD19-T后转化*** DH5α，通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定，得到ACS基因片段的克隆。（2）蝴蝶兰ACS反义基因中间载体pBI221-ACS的构建与鉴定完成基因的克隆和测序后，利用DNA重组技术，将蝴蝶兰ACS基因片段以反义的方向插入到中间载体pBI221CaMV35S启动子的下游，后转化*** DH5α，通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定，证明蝴蝶兰ACS反义基因中间载体pRI221-RACS成功构建。（3）蝴蝶兰ACS反义基因植物表达载体pCAMBIA3301-RACS的构建与鉴定将中间载体pBI221-RACS酶切后，获得含有CaMV35S启动子的ACS反义基因片段。将此包含启动子的反义基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA3301中，获得ACS基因反义植物表达载体，后转化*** DH5α，通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定，证明蝴蝶兰反义基因植物表达载体pCAMBIA3301-RACS成功构建。（4）pCAMBIA3301-RACS质粒转化根癌农杆菌将重组质粒pCAMBIA3301-RACS通过直接转化法导入根癌农杆菌EHA105中，用利福平（Rif）和卡那霉素（Kana）进行筛选得到阳性克隆，通过质粒PCR、双酶切鉴定，证明重组质粒成功转化根癌农杆菌EHA105。（5）植株再生体系的建立采用无菌蝴蝶兰种子为材料，以MS为基本培养基，筛选出播种培养基：1/3MS+KT0.5mg/L+AC1.0g/L+蛋白胨1g/L+椰汁15.0%，分化培养基：1/3MS+NAA0.5mg/L+6-BA5.0g/L，增殖培培养基：Hyponex12.5g/L+Hyponex20.5g/L+6-BA5.0g/L+椰汁10.0%，生根培养基：Hyponex13.0g/L+NAA0.3mg/L。（6）转化体筛选及植株再生将预培养2-3天的外植体与农杆菌菌液浸染90-120分钟后，共培养2-3天，然后转化到含Mer和PPT的选择培养基上进行分化筛选，转入外源基因的原球茎将会在这一系列筛选过程中发芽、生根，获得转基因植株。（7）转基因植株PCR检测采用GUS组织化学染色法对蝴蝶兰的转化植株进行了检验和筛选，并用PCR对蝴蝶兰的转化植株进行了分子检验，得到了反义基因的转化植株。

关键词：蝴蝶兰 ACC合成酶反义基因表达载体的构建遗传转化

植物甜蛋白基因Thaumatin表达载体的构建及对雪莲果的遗传转化

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植物甜蛋白基因Thaumatin表达载体的构建及对雪莲果的遗传转化

作者：蒋素华河南农业大学

学位级别：硕士

甜蛋白(Thaumatin)存在于西非热带雨林中一种竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果实胶质假种皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它还具有低热量、安全无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点,是一类高甜度而又... 详细信息

甜蛋白(Thaumatin)存在于西非热带雨林中一种竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果实胶质假种皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它还具有低热量、安全无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点,是一类高甜度而又不含糖的新型甜味剂,所以它被认为有希望发展成为食品工业中营养性碳水化合物的替代品而成为未来新型的甜味剂。但是T. daniellii在原产地之外不能正常结实,并且引种不成功难以大量生产,致使甜味蛋白成为十分昂贵的商品。生物技术的迅速发展启发人们用基因重组的手段开发甜蛋白,对这些甜味蛋白和矫味蛋白进行了克隆和测序,并将其表达于其他宿主。已经实现了甜蛋白在微生物中的表达,个别的还在一些植物中得到表达。因此,本试验在吸取前人经验的基础上,构建了植物表达载体pBI121- Thaumatin,并将其转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌的介导将Thaumatin基因导入雪莲果中,并对转基因植株进行了检测,借以初步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况,为进一步转化园艺植物打下了基础。实验结果如下:(1)甜蛋白Thaumatin基因的人工合成和克隆本实验根据已报道的Thaumatin基因序列,采用重叠延伸PCR法人工合成Thaumatin全长基因,与T载体pMD19-T连接后转化DH5α,通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定,得到克隆载体pMD-Thaumatin。(2)甜蛋白Thaumatin基因植物表达质粒pBI121- Thaumatin的构建与鉴定。利用DNA重组技术,将植物甜蛋白Thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,通过PCR、酶切、电泳鉴定Thaumatin基因已成功构建到植物表达质粒pBI121中。(3)pBI121- Thaumatin质粒转化根癌农杆菌重组质粒pBI121- Thaumatin通过直接转化法导入农杆菌EHA105中,利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)平板筛选阳性克隆,有单菌落生长,经过菌液PCR鉴定,证明重组质粒已转进农杆菌EHA105中。(4)植株再生体系的建立采用无菌苗雪莲果(Smallanthus sonchifolius)叶片为外植体,以MS为基本培养基,筛选出MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L形成愈伤组织, MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L以诱导不定芽的分化,并于1/2MS+NAA0.2mg/L生根培养,获得完整再生植株。(5)转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的外植体与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和Kan的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。(6)转基因植株PCR检测提取转基因植株基因组DNA后,PCR扩增Thaumatin基因,证明thaumatin基因已导入雪莲果中,转化率为36.4%。

关键词： Thaumatin基因表达载体的构建雪莲果再生体系的建立遗传转化

玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

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激光生物学报 2006年第3期15卷 288-293页

作者：项艳张永凤江海洋韩国民朱苏文程备久安徽农业大学林学与园林学院安徽合肥230036

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用***与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300+HMW+2F。... 详细信息

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用***与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300+HMW+2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300+HMW+2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。

关键词：淀粉分支酶基因小干涉RNA 表达载体的构建玉米农杆菌介导

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TAT-BPI融合蛋白原核表达载体的构建

中国实用医刊 2010年第9期37卷 33-35页

作者：赵院霞阚全程余祖江郑州大学第一附属医院药剂科 450052 郑州大学第一附属医院感染科 450052

目的探讨使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障,中和不同解剖部位的LPS,构建TAT-BPI原核表达载体并鉴定的方法,为研制多肽抗生素打下基础.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pUC57后得到pUC57-TAT重组质粒;提取正常人外... 详细信息

目的探讨使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障,中和不同解剖部位的LPS,构建TAT-BPI原核表达载体并鉴定的方法,为研制多肽抗生素打下基础.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pUC57后得到pUC57-TAT重组质粒;提取正常人外周血多形核粒细胞总RNA, 采用RT-PCR技术扩增BPI N端cDNA片段,构建pUC57-TAT-BPI克隆载体;用酶切和双脱氧测序法进行鉴定.结果获得含有约630 bp的TAT-BPI融合蛋白基因片段序列,测序分析与Genebank中该序列相符,同源性分析TAT序列中第10、30位核苷酸有突变,氨基酸同源性为93%,蛋白质同源性为90%,在BPI序列中234、454、495、556位核苷酸有突变,氨基酸同源性为98%,蛋白质同源性为95%.结论成功构建了TAT-BPI融合蛋白的原核表达载体,为进一步研究BPI的抗菌作用奠定了基础.

关键词：融合蛋白原核表达载体表达载体的构建 expression vector BPI Restriction enzyme 氨基酸同源性 TAT protein polymorphonuclear neutrophils DNA sequence analysis 基因片段序列 human cell membrane 双脱氧测序法核苷酸多形核粒细胞蛋白质 DNA fragment 同源性分析多肽抗生素

日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建及序列分析

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江西农业学报 2010年第11期22卷 8-10,14页

作者：方桂杰乔宪凤湖北工业大学生物工程学院发酵工程省部共建教育部重点实验室湖北武汉430068 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室湖北武汉430064

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因... 详细信息

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因进行比对并对可能的表达产物进行分析。结果表明,PCR产物与3种sjGST基因有99%的同源性。重组载体构建成功。

关键词：日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建序列分析 Schistosoma japonicum Sequence Analysis 基因测序重组载体构建组氨酸标签生物学软件表达产物 PCR产物 his-tag GST基因同源性代表性 pET28a 模板酶切

油菜BcNA1启动子与拟南芥Fad2基因的克隆及相关植物表达载体的构建

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云南大学学报（自然科学版） 1999年第S3期21卷 47-47页

作者：石东乔周奕华张丽华刘桂珍陈正华中国科学院遗传研究所北京100101