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慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞克隆的基因表达谱和蛋白谱分析

慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞克隆的基因表达谱和蛋白谱分析

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作者：李睿夫第三军医大学

学位级别：硕士

在大面积深度烧伤病人的救治中，尽早的进行皮肤移植修复创面是治疗成功的关键所在。但大面积烧伤患者自体皮源的缺乏往往限制了早期大面积植皮的可能。异体皮和异种皮移植成为了有效地替代方案[1]。其中，异体皮移植相比异种皮移植，... 详细信息

在大面积深度烧伤病人的救治中，尽早的进行皮肤移植修复创面是治疗成功的关键所在。但大面积烧伤患者自体皮源的缺乏往往限制了早期大面积植皮的可能。异体皮和异种皮移植成为了有效地替代方案[1]。其中，异体皮移植相比异种皮移植，其组织结构与人体相同，且有着较低的免疫原性。异体皮作为临时的创面覆盖物，不仅可为自、异体皮肤混合移植术提供良好的局部创面愈合条件，而且还可形成新的暂时体表屏障，避免或减轻创面感染，减少创面渗出，从而减轻烧伤后的全身病理生理改变。然而，异体皮移植同样面临着供体和皮源不足的问题，使其价格高昂，作为临时的皮肤替代物难以为大部分患者所接受。同时，必然存在的排异反应也使其移植效果难以预计。为了解决皮源缺乏的问题，人们将目光转向了组织工程皮肤的研究，通过在人造真皮支架材料上种植人皮肤种子细胞形成组织工程皮肤，以之作为异体皮的替代物覆盖创面。其中，皮肤种子细胞作为组织工程皮肤的主要生物学成分，是其发挥生物学作用的核心[2]。在之前的研究中，我们采用CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体转染人永生化角质形成细胞（HaCaT），获得了稳定转染，长期表达RNA干扰效果，CCL20稳定敲低的转染株HaCaT细胞[3]。CCL20基因特异性敲低的转染株细胞，有着较低的免疫源性，同时也保留了HaCaT细胞的永生化和易培养的特性。作为低免疫排斥反应的皮肤组织工程种子细胞具有独特的优势。在后续实验中，我们发现，获得稳定转染的多株转染株细胞其细胞生长特性无论是在生长曲线还是细胞周期上相对未转染的HaCaT细胞都发生了较大的改变[4]。众所周知，CCL20作为免疫细胞的诱导趋化因子，其生物学功能明确，在体外培养和非炎症条件下极少发挥生物学作用。从既往文献报道和相关体外研究实验中，都未发现CCL20基因的改变会造成细胞生长特性发生变化的例子[5]。因此，我们有相信，这种改变并非来自CCL20基因的敲低，而是慢病毒载体对细胞的转染造成的，是慢病毒载体DNA对宿主细胞基因组的大量插入的结果[6]。在基因工程和基因疗法中，病毒载体转染造成的不可预计的宿主基因组改变一直是造成操作失败乃至产生严重副作用的原因。而最为严重的副作用莫过于宿主细胞产生成瘤性。众所周知，皮肤源性的肿瘤的发生本来就与以人乳头瘤病毒（HPV）为代表的多种病毒的感染相关[7]。因此慢病毒转染的HaCaT细胞同样存在产生成瘤性的可能，而细胞生长特性的改变正是值得警惕的信号之一。考虑到蛋白质作为发挥细胞生物学功能的基础物质，直接决定细胞的表型。为了初步了解慢病毒载体对转染株细胞在蛋白层面造成了什么样的影响，我们采用二维电泳技术对转染株细胞进行了差异蛋白组学分析。电泳结果显示转染株细胞相较HaCaT细胞存在一定程度上蛋白表达的改变。我们选取了部分差异蛋白进行了质谱鉴定，并对差异蛋白中的核纤层蛋白B1进行了RT-PCR和WB验证。并初步分析了上游因子caspase6(细胞凋亡蛋白酶6)的活性和核纤层蛋白B1的关系。为了进一步更加全面和深入的分析慢病毒载体对各转染株细胞的影响，我们采用人表达谱芯片（Agilent SurePrint G3Human GE8*60K Microarray, Agilent Technologies，USA）和iTRAQ技术对转染株细胞和HaCaT细胞的表达谱和蛋白谱进行了检测，绘制了更加详尽的表达谱和蛋白谱。通过一系列的生物信息学分析，了解慢病毒载体转染对皮肤种子细胞基因表达和蛋白表达产生的影响，分析慢病毒转染人角质形成细胞基因转录和蛋白表达的变化规律，并结合慢病毒载体的基因内整合位点信息进一步探索造成种子细胞表型改变的可能原因和的成瘤性隐患，材料与方法：第一部分慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞差异蛋白组学检测及高表达核纤层蛋白B1的分析我们选择生长曲线发生明显改变的第Ⅰ株转染株细胞作为实验组，以未转染HaCaT细胞作为对照组。提取细胞总蛋白后实验组与对照组一一配对后进行二维电泳，各进行三次生物学重复。采集电泳图像，进行差异蛋白分析。选择其中表达改变最为明显的部分蛋白点切胶后进行质谱鉴定。选择差异蛋白中的核纤层蛋白B1，通过RT-PCR和WB技术对其mRNA含量和蛋白含量进行定量验证。再通过采用不同浓度顺铂诱导caspase6激活后，观察不同caspase6活性情况下，核纤层蛋白B1的表达情况，了解caspase6活性与核纤层蛋白B1含量的关系。第二部分慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞克隆的表达谱和蛋白谱分析我们选择生长曲线发生明显改变的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅲ株转染株细胞作为实验组，以未转染HaCaT细胞作为对照组。提取细胞总RNA，对提取的总RNA纯化后进行质检。确认RNA质量符合检测要求后，对总RNA中的mRNA进行放大和标记，并对标记后的cRNA进一步进行纯化。将纯化后的cRNA与表达谱芯片在杂交炉中进行杂交，洗片后扫描芯片，对原始

关键词： HaCaT 慢病毒载体二维电泳 CCL20基因表达谱芯片差异表达谱 iTRAQ 差异蛋白谱生物信息学

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奶牛乳房炎QTL与微阵列数据挖掘及全基因组关联分析

奶牛乳房炎QTL与微阵列数据挖掘及全基因组关联分析

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作者：赵静上海交通大学

学位级别：硕士

奶牛乳房炎是奶牛养殖业最常见、最复杂的疾病之一,也是制约奶业发展的重要因素。奶牛乳房炎作为乳腺的一种炎症,是由遗传因素、环境因素、病原体、管理因素等综合因素作用的结果,然而到目前为止,奶牛乳房炎的相关机理,特别是其遗传抗... 详细信息

奶牛乳房炎是奶牛养殖业最常见、最复杂的疾病之一,也是制约奶业发展的重要因素。奶牛乳房炎作为乳腺的一种炎症,是由遗传因素、环境因素、病原体、管理因素等综合因素作用的结果,然而到目前为止,奶牛乳房炎的相关机理,特别是其遗传抗性机制还不是特别清楚。随着统计基因组学、芯片技术和高通量测序技术的发展,使我们从基因组和表达组层面全面研究乳房炎抗性机制成为可能。在基因组层面,虽然已经大量开展数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)定位的研究,但因QTL区间跨度太大,其研究成果仍不能很好地运用到育种实践中,因此对QTL的深入挖掘十分必要。据此,本研究分别从基因组和表达组两个层面系统挖掘奶牛乳房炎相关的候选基因集,并基于真实的奶牛乳房炎表型数据和简化测序数据初步核实验证相关基因集合,具体开展工作如下:一、基因组层面挖掘奶牛乳房炎相关的候选基因集:本研究先从当前QTL数据库中收集整理了关于奶牛乳房炎的QTL共76个,通过数据库的对比,发现QTL内共包含1336个基因。我们进一步从GO、KEGG、IPA三个方面对这些基因进行分析,分别得到42、182、91个基因可能与奶牛乳房炎相关,去冗余后三个分析总共发现284个基因组成奶牛乳房炎候选基因集。对比分析结果显示,其中三个分析结果中有1个共同基因即FABP4基因;GO、KEGG分析结果中有7个共同基因即LIAS、HPSE、COQ3、ENPP3、ENPP1、APOA1和IDO1基因;GO、IPA分析结果中有2个共同基因即BMPR1B和FAM103A1;KEGG、IPA分析结果中有20个共同基因即PPT1、GCNT1、ST3GAL1、ATP6V1F、ATP6V1H、FUT9、FUT4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ST3GAL3、ATP6V0B、PTS、DGKD、AASS、MTHFD1L、LAP3、SCD5、MYC和UCHL1基因。二、表达组层面挖掘奶牛乳房炎相关的候选基因集:本研究先从NCBI的GEO数据库中收集了五套已发表的Affymetrix平台的与奶牛乳房炎的发生发展相关的全基因组表达谱芯片数据,分别为GSE24560、GSE24217、GSE32186、GSE25413、GSE15025,实验设计分别是基于大肠杆菌感染。然后利用基因集富集分析法(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)进行分析,分别得到显著上调和下调通路。最后根据感染时间分别进行整合分析,其中1、6、24 h分别得到共同的显著下调通路为15、30、17个,整合所有的结果发现5个共同通路,包括趋化因子信号通路(Chemokine signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、查加斯病通路(Chagas disease(American trypanosomiasis),弓形虫病通路(Toxoplasmosis)和MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)。三、奶牛乳房炎候选基因集初步核实验证:通过全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)方法对奶牛乳房炎的遗传机制进行研究,我们首先利用本实验室开发的GGRS测序平台对278头奶牛进行简化基因组测序,共获得108,936个SNP。然后利用ssGWAS方法进行GWAS,发现716个显著SNP位点(显著性阈值为0.05/108936(28)4.59?10),占所有SNP数的0.66%。我们进一步对上述GO分析,KEGG分析和IPA在线分析得到284个基因与GWAS结果进行核实验证。被检测出的108,936个SNP中落在284个基因内的SNP共497个,其中显著阈值以上的SNP有48个,占奶牛候选基因内总SNP数的比例为9.66%。对两个显著SNP比率进行卡方检验,结果显示两者之间存在显著差异,这在一定程度上说明我们发现的奶牛乳房炎候选基因集的准确性较好。

关键词： QTL 通路表达谱芯片奶牛乳房炎基因

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多数据库联合分析卵巢癌转移相关基因

多数据库联合分析卵巢癌转移相关基因

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作者：万冬一华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous carcinomas,HGSC)不仅在临床表现上呈现高度的异质性,在分子水平也是如此,因此本文从公共数据库分析入手,找到并验证卵巢癌转移相关基因。【方法】用R语言分析已共享的HGSC的表达谱芯片,... 详细信息

【目的】高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous carcinomas,HGSC)不仅在临床表现上呈现高度的异质性,在分子水平也是如此,因此本文从公共数据库分析入手,找到并验证卵巢癌转移相关基因。【方法】用R语言分析已共享的HGSC的表达谱芯片,分析出转移灶相对于原位灶的差异基因;采用Bioconductor中的curated Ovarian Data包,对全基因组每个基因进行meta分析,获得该基因与无进展生存(PFS)的HR值及其p值;将芯片分析的差异基因和meta分析的结果合并后,按照综合效应得出了候选基因,并在临床标本上验证。【结果】表达谱芯片GSE2109共有222例,剔除掉非HGSC后剩余124例,在R语言中通过质控剔除不合格芯片后剩余90例。其中HGSC原位灶共62例,网膜转移灶共28例。采用gcrma方式标准化后,本文用SAM检验得到差异基因若干。通过R语言包curated Ovarian Data筛选出7个包含PFS临床信息的数据集,并用meta分析获得全部基因对PFS的风险比(Hazard Ratio,HR)值及其p值。将差异基因和Gene Meta的结果综合分析后,得到了在原位和转移灶差异表达且与临床预后相关的基因,且这两种数据具有很好的线性关系。这些基因的top100通过pathway分析确认其主要富集在转移相关通路。取前12的基因设计引物后在本院临床标本中进行验证,所得结论与前述相符。【结论】采用生物信息学加临床验证的方式挑选出的转移相关基因,且从统计学和临床标本的角度验证了这些结果。这些基因可能参与了HGSC的侵袭转移过程。对于临床的意义在于,对其干预可能阻止肿瘤的侵袭转移,也可以作为肿瘤发生转移的分子标志,或者可以用来对预后进行评估。

关键词：生物信息学 Meta 表达谱芯片卵巢癌侵袭转移

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MTB特异性蛋白CFP10和ESAT6在结核诊断中临床应用及作用机制的研究

MTB特异性蛋白CFP10和ESAT6在结核诊断中临床应用及作用机制的研究

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作者：王晓玮安徽医科大学

学位级别：硕士

背景自古以来,结核分枝杆菌(MTB)作为一种具有极强传染性的微生物,引起的结核病一直威胁着人类以及许多其他动物的健康。据最新统计,全球新增约960万人/年感染活动性结核杆菌,有近150万人/年死于结核病及其相关并发症。在感染初早期快... 详细信息

背景自古以来,结核分枝杆菌(MTB)作为一种具有极强传染性的微生物,引起的结核病一直威胁着人类以及许多其他动物的健康。据最新统计,全球新增约960万人/年感染活动性结核杆菌,有近150万人/年死于结核病及其相关并发症。在感染初早期快速且准确的检出结核杆菌及早开始治疗可大大降低结核在人群中的播散。作为近几年来快速发展的、可检测抗原特异度细胞免疫应答反应的新技术,ELISP OT已被证明可用于诊断结核的活动性与潜伏性感染。但基于该原理的诊断试剂鲜有新的改进。主要由于该检验方法的主要影响条件尚不够明确。全基因组表达谱芯片技术是近几年来逐步发展成熟的一种可以在同一时间检测大量基因的表达的新的检测方法,其具有高通量和高灵敏性的特性。当前主要的研究集中在ELISPOT是否可以正确快速的诊断不同人群、不同种类的结核,对于如何提高其诊断性能的研究较少。目的验证重组特异性蛋白ESAT-6及CFP-10的生物活性,建立具有较高灵敏度和特异性的ELISPOT方法。以基因芯片为基础,通过生物信息结果分析探讨影响结核特异性蛋白ESAT-6及CFP-10作用于特异性T淋巴细胞的主要机制。方法以聚合酶链反应(PCR)扩增CFP-10及ESAT-6基因片段,构建原核表达重组质粒。重组质粒转化后,经IPTG诱导表达后通过亲和层析法纯化CFP10和ESAT6重组蛋白,分别分析其蛋白纯度。通过条件梯度的摸索建立可应用于临床的ELISPOT方法确定适合的ELISPOT方法实验条件。通过磁珠分选技术分选出CD4阳性的淋巴细胞,选取合适的表达谱基因芯片,筛选出蛋白刺激前后显著差异表达的基因位点,根据GO分析及KEGG分析,预测其对应的通路。为今后的实验建立起对应的结构布局。结果1.本实验室现已构建稳定的特异性蛋白表达体系,根据实验条件建立了ELISOPT技术检测结核杆菌感染的一系列实验步骤。2.与T-Spot试剂盒进行对比,ELISPOT的特异度与灵敏度分别为82.35%和88.50%(χ2=0.57,P>0.05),差异无统计学意义。3.通过芯片检测刺激前后结核病人T细胞的差异位点,CFP-10刺激后表达上升相对应基因参与BP的GO条目共1138条,参与CC的GO条目共31条,参与MF的GO条目共59条;表达下降相对应基因参与BP条目共1273条,参与CC条目共154条,参与MF条目共181条。ESAT-6刺激后表达上升相对应基因参与BP的GO条目共1295条,参与CC的GO条目共112条,参与MF的GO条目共71条;表达下降相对应基因参与BP条目共1089条,参与CC条目共112条,参与MF条目共139条。4.联合KEGG与差异表达基因的分析,上升和下降的通路中,CFP-10组与结核及IFN-γ相关的信号通路如下细胞因子受体相互作用、Toll样受体、JAK-STAT、细胞粘附等;ESAT-6组与结核及IFN-γ相关的信号通路如下JAK-STAT、Toll样受体、NF-κB、PI3K-Akt等。结论本研究结果显示本实验室建立的ELISPOT具有较好的灵敏度和特异性,可基本进行临床标本的筛查,降低了检测成本。通过基因芯片结果分析,可筛选出差异性较高的基因位点,且与IFN-γ分泌及结核感染多存在一定的相关性,为后续机制的研究明确了方向。

关键词： ESAT‐6 CFP‐10 蛋白表达 MTB诊断表达谱芯片

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去分化人脐带间充质干细胞通过hSDF-1α参与缺氧缺血性脑损伤大鼠神经修复研究

去分化人脐带间充质干细胞通过hSDF-1α参与缺氧缺血性脑损伤大鼠...

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作者：代梦洁重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分 De-hUC-MSCs生物学特性及对HIBD模型大鼠神经修复作用目的:将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchym al stem cells,hUC-MSCs)进行去分化诱导成去分化人脐带间充质干细胞(Dedifferentiation human umbilical cord mesenchymal stem cells,De-hUC-MSCs),对De-hUC-MSCs基本的生物学特性进行鉴定。通过体内实验明确De-hUC-MSCs移植对HIBD大鼠的神经修护作用。利用基因芯片分析hUC-MSCs与De-hUC-MSCs全基因表达模式,并探讨D e-hUC-MSCs发挥神经修复的可能机制。方法:将hUC-MSCs用MNM神经诱导液进行去分化诱导,倒置显微镜下观察两组细胞形态;流式细胞术检测hUC-MSCs与De-hUC-MSCs 表面标志物 CD29、CD44、CD34、CD45、CD90、HLA-DR、CD105、HLA-ABC 表达情况;CCK-8 试剂盒检测 hUC-MSCs与De-hUC-MSCs增殖台能力;对hUC-MSCs与De-hUC-MSCs进行成骨、成脂、成软骨三向分化能力检测;RT-PCR、Western Blot检测两组细胞神经标志物和干性基因。对7 日龄SD大鼠建立HIBD模型,建模后第5d,将实验大鼠随机分为PBS组(n=15)、hUC-MSCs移植组(n=19)和De-hUC-MSCs移植组(n=14)。各组大鼠麻醉后,使用脑立体定位仪进行侧脑室细胞移植,细胞悬液5μL/只(约2x105个细胞),PBS组给予5μL灭菌PBS。三组大鼠在细胞移植后第2d,取左侧脑组织石蜡切片行免疫染色。细胞移植1月后,Morris水迷宫和Object-in-place行为学实验检测三组实验大鼠学习记忆功能和新事物探索功能。对hUC-MSCs和去分化hUC-MSCs进行全基因芯片分析;对两组细胞差异基因进行分析。结果:(1)hUC-MSCs能成功诱导为De-hUC-MSCs,两种细胞都呈旋涡状贴壁生长,呈梭形或针尖样。(2)流式细胞技术鉴定hUC-MSCs和 De-hUC-MSCs,两种细胞均阳性表达 CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC,阴性表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。C3)hUC-MSCs 和De-hUC-MSCs的增殖曲线类似,1-10d为增长期,其中3-6d为对数增长期,10d之后增殖呈下降趋势。(4)hUC-MSCs和De-hUC-MSCs可经诱导向成骨,成脂,成软骨分化。(5)De-hUC-MSCs神经标志物MAP2、NSE、tau、β-tubulinⅢ 表达明显高于 hUC-MSCs 组(***P表达情况进行验证,得到一致的检测结果。(6)与hUC-MSCs组相比,De-hUC-MSCs组干性基因C-MYC及NANOG基因表达明显增高(**P表达Oct4和SOX2基因无差异。Western Blotting 结果显示 De-hUC-MSCs 组中 C-MYC 及 NANOG 蛋白表达高于 hUC-MSCs 组。(7)De-hUC-MSCs 移植组 Brdu/nestin 阳性细胞较hUC-MSCs组多。(8)Morris水迷宫实验结果显示:在第1d,PBS组、hUC-MSCs移植组和De-hUC-MSCs移植组大鼠平台测试中找到平台所用的距离和时间无统计学差异(P>0.05)。在第2-5d,各组实验大鼠找到平台所用时间较第1d均有减少,其中De-hUC-MSCs组所用时间最短(**P表达谱芯片检测hUC-MSCs、De-hUC-MSCs两组细胞全基因表达模式相似;通过全基因表达谱芯片检测,发现hSDF-1α是De-hUC-MSCs和hUC-MSCs两种细胞表达差异最大的基因;RT-PCR 验证 De-hUC-MSCs 高表达 hSDF-1α。结论:(1)De-hUC-MSCs具有hMSCs的形态特征及表面标志物;具有较强的增殖能力;具有成骨、成脂、成软骨分化潜能;高表达神经标志物和干性基因。(2)De-hUC-MSCs移植较hUC-MSCs移植更能促进HIBD大鼠脑组织神经再生、空间学习记忆及新事物的探索能力提高。(3)hUC-MSCs、

关键词：去分化人脐带间充质干细胞 HIBD 表达谱芯片 hSDF-1α 稳定细胞株血管生成神经生成

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pp GalNac-T10在肺腺癌发生发展中的作用及机制的初步研究

pp GalNac-T10在肺腺癌发生发展中的作用及机制的初步研究

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作者：姜浩元南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(pp GalNac-T10)是多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员之一。根据已有研究推测pp GalNac-T10的异常表达可能与肿瘤侵袭转移和恶性生长密切相关,在肺腺癌的组织芯片中发现pp GalNac-T10在癌组织的... 详细信息

研究背景多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(pp GalNac-T10)是多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员之一。根据已有研究推测pp GalNac-T10的异常表达可能与肿瘤侵袭转移和恶性生长密切相关,在肺腺癌的组织芯片中发现pp GalNac-T10在癌组织的阳性率比癌旁组织中低,但是其细胞生物学功能及其分子作用机制仍需进一步探究。研究方法1、为了选择合适的细胞系进行本研究,首先通过qPCR和Western blot实验测定不同肺腺癌细胞系的GalNac-T10的mRNA水平和蛋白水平的表达量,以匹配相应的过表达质粒和干扰质粒。2、A549和H322细胞分别转染对应干扰GalNac-T10质粒和过表达GalNac-T10质粒后,通过CCK8实验检测各组细胞的OD值变化,以检测细胞的增殖能力。3、通过流式细胞仪,检测不同处理组细胞的周期分布变化,细胞凋亡变化。研究GalNac-T10高表达或低表达后对A549和H322细胞的增殖凋亡的影响。4、细胞转染后通过Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭的细胞数,反映细胞的侵袭能力。研究pp GalNac-T10高表达或低表达后对对A549和H322细胞侵袭的影响。5、对已改变pp GalNac-T10的肺腺癌细胞系用基因表达谱芯片检测,检测因ppGalNac-T10表达改变而改变的显著差异基因。6、对找出的差异基因进行生物信息学的数据分析,找出pp GalNac-T10影响肺腺癌的潜在下游基因,为进一步研究pp GalNac-T10调控肺腺癌的分子机制打好基础。研究结果不同处理组的CCK8实验表明,上调pp GalNac-T10在细胞中的表达会显著抑制肺腺癌细胞的增殖,相反下调pp GalNac-T10也会一定程度上促进肺腺癌细胞的增殖。2.流式细胞周期实验结果显示上调pp GalNac-T10会使细胞停滞在G1期,抑制细胞增殖,下调pp GalNac-T10的结果正好相反,会促进细胞增殖,细胞凋亡实验表明上调pp GalNac-T10会促进细胞凋亡。3.在Transwell侵袭实验中,下调pp GalNac-T10表达的A549细胞中穿过基质胶的细胞变多,说明细胞侵袭能力变强,上调ppGalNac-T10的H322细胞的侵袭能力一定程度上变弱。这些结果表明pp GalNac-T10可能在肺腺癌发生发展过程中起到抑制作用,与预实验中组织芯片的结果一致。4.对相应的H322细胞和A549细胞进行表达谱芯片分析,结果表明,上调ppGalNac-T10处理组有932个显著表达差异基因,下调pp GalNac-T10处理组有1073个显著表达差异基因。pp GalNac-T10在TGF-beta通路中的潜在下游基因有 AMH,BMP2,ID1,ID3,SMAD1,SMAD9,ACVR1,DCN,FST,MAPK3,RHOA,在EGFR相关通路中的潜在下游基因有AXL,BAX,EGFR,EIF4E,ERBB3,FGF2,GAS6,IL6,MAPK3,NRAS,NRG1,PTEN,BCL2L11,FGFR3,NF1,PDGFA,PDGFB,PIK3CB,VEGFA。5.在进一步探索性数据分析后,发现芯片数据中显著差异基因的生物进程和通路富集主要涉及到p53信号通路和Fox0信号通路。研究结论在细胞功能实验中,上调pp GalNAc-T10会抑制肺腺癌细胞系的增殖和侵袭,也会促进凋亡,将细胞周期阻滞在G0/G1期;pp GalNAc-T10在肺腺癌中属于抑癌基因。pp GalNAc-T10在TGF-beta通路中的主要相关基因有AMH,BMP2,ID1等,在EGFR通路中的主要相关基因AXL,BAX,GAS6等,他们均可能是ppGalNAc-T1O的下游基因。另外,pp GalNAc-T10在肺腺癌中与p53通路和FoxO通路等的相关十分密切,值得深入研究。

关键词： pp GalNac-T10 肺腺癌表达谱芯片细胞凋亡细胞增殖细胞侵袭

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放疗对口腔颌面部肿瘤患者免疫功能影响的实验研究

放疗对口腔颌面部肿瘤患者免疫功能影响的实验研究

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作者：孔月虹上海交通大学

学位级别：硕士

研究目的放疗对机体免疫调控机制尚不明确。既往研究表明,放疗对患者免疫功能不仅存在抑制作用,也可能同时存在激活作用。如何增强放疗对免疫功能的正向调节作用,抑制放疗对免疫的负向调节作用,成为放射治疗的研究热点之一。本研究通过... 详细信息

研究目的放疗对机体免疫调控机制尚不明确。既往研究表明,放疗对患者免疫功能不仅存在抑制作用,也可能同时存在激活作用。如何增强放疗对免疫功能的正向调节作用,抑制放疗对免疫的负向调节作用,成为放射治疗的研究热点之一。本研究通过观察放疗前后患者外周血免疫细胞数目改变规律,研究常规分割放疗对口腔颌面部肿瘤患者免疫功能的影响;运用外周血全基因组表达谱芯片,以及生物信息学方法研究免疫细胞激活效应和抑制效应的分子机制;运用RT-PCR技术确认分子改变的结果,为放疗结合免疫治疗口腔颌面肿瘤提供新的依据。研究方法1.放疗前后淋巴细胞及其亚群检测:分别抽取22例患者放射治疗前1周内及放射治疗结束后1周内外周血,行白细胞及淋巴细胞计数,及进行CD3T细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、NK细胞、B细胞等指标检测。2.放疗前后白细胞外周血表达谱芯片检测:选取14例口腔鳞癌患者,分别采取放疗前后外周血,提取RNA,行表达谱芯片分析,并用生物信息学方法筛选出放疗前后的差异基因,对差异基因行GO分类、KEGG通路分析,并结合淋巴细胞亚类计数改变做差异共表达分析。3.RT-PCR验证:通过生物信息学分析,筛选出10个淋巴细胞亚类计数关键的基因行RT-PCR验证,并用统计学方法比较PCR结果与淋巴细胞亚类数目的相关性。研究结果1.放疗后患者外周血淋巴细胞中CD3T细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞及NK细胞,均较放疗前显著下降,且有统计学差异(P0.05),CD4T、B细胞百分率及CD4/CD8比值放疗后明显下降,差别有统计学意义(P表达谱芯片鉴定到1202个差异表达的转录本(探针水平),映射到743个基因。其中1041个转录本,对应623个基因下调,161个转录本,对应120个基因上调。GESA富集分析到核糖体通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、原发免疫缺陷、细胞-细胞因子相互作用、细胞循环等生物学分类。差异共表达分析显示共有161个基因(对应235个探针)与各种细胞计数差异共表达。KEGG通路分析显示差异共表达相关基因主要富集在5个通路。3.PCR验证结果显示CD3D、CD8B、FYN、GIMAP5、IL7R、KLPK1、LY9、MS4A1、PPP3CC、ZAP70在放疗后表达量较放疗前显著下降,且差别有统计学差异(P表达谱芯片分析,放疗后主要抑制的信号通路为核糖体通路、T、B细胞受体信号通路、NK介导的细胞毒性信号通路等,特别是发现核糖体信号通路的抑制,文献报道较少,其机制,功能及修复的进一步研究,可能为放疗后患者免疫功能研究提供新思路。3.PCR结果显示与CD3细胞计数相关的基因有CD3D、KLRK1、LY9、PPP3CC四个;与CD4细胞计数相关的基因有IL7R、LY9两个;与CD8细胞计数相关的基因有CD3D、GIMAP5两个。这些关键基因既可能是反应放疗对患者免疫功能影响的血液分子标志物,亦是放疗患者免疫治疗的新靶点。

关键词：放射疗法口腔颌面肿瘤免疫功能表达谱芯片外周血

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六溴环十二烷（HBCD）对黑点青鳉仔鱼神经系统和运动影响的研究

六溴环十二烷（HBCD）对黑点青鳉仔鱼神经系统和运动影响的研究

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作者：王雅静厦门大学

学位级别：硕士

六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane, HBCD)是在全球范围内广泛使用的添加型溴化阻燃剂。是一种常见的持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs),容易在环境中累积,并通过食物链传递进入生物体甚至人体内,对环境和人体... 详细信息

六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane, HBCD)是在全球范围内广泛使用的添加型溴化阻燃剂。是一种常见的持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs),容易在环境中累积,并通过食物链传递进入生物体甚至人体内,对环境和人体健康都具有很大危害。本研究以黑点青鲻(Oryzias melastigma)作为动物模型,采用较低水平(0、0.2、2和20nM)的六溴环十二烷对囊胚期胚胎至15dpf的仔鱼进行暴露。探究较低浓度的HBCD对黑点青鲻仔鱼游泳行为和神经系统的影响。同时,结合商品化的表达谱芯片筛选与神经系统和运动相关的基因,为HBCD对黑点青鲻的影响寻找可能的靶基因,探讨HBCD对海洋鱼类毒性效应的机制。 HBCD暴露囊胚期胚胎,暴露组死亡率显著高于对照组。孵化率呈剂量依赖性下降,最高浓度组与对照组差异显著。畸形率在各暴露组中数量都很少,与对照组没有明显差异。HBCD暴露6天和13天的胚胎心率都有剂量依赖性上升。 HBCD暴露降低仔鱼运动能力,一定时间内的游泳总距离缩短,平均游速降低。对机械触碰的反应能力降低。相关ATPase的活性发生变化。脑部特别是在与运动密切相关的后脑,GAP-43和AIMP1的表达量都有明显下降。脑部凋亡细胞增加。侧线神经丘的数目减少,使仔鱼对外界变化的感受能力下降。HBCD使仔鱼ACh水平升高,ChAT和AChE的活性也都出现相应的上升。结果表明,HBCD暴露对神经系统造成毒性作用,并且可能因此进一步影响了运动能力。结合MAS3.0、CTD、KEGG等数据库,我们从差异表达基因中筛选出一些与神经毒性及运动相关的基因。对这些基因进行聚类分析,及预测调控网络。对进一步研究HBCD对黑点青鳉神经系统及运动能力影响的机制有一定指示作用。综上所述,本研究结果表明,较低浓度的HBCD暴露对黑点青鳉仔鱼的运动能力产生影响,而这种影响可能是由HBCD的神经毒性引起的。从毒理基因芯片预测外源化合物毒性具有一定可行性,能为进一步研究HBCD的毒性效应及具体的分子机制提供线索。

关键词：六溴环十二烷黑点青鳉神经运动表达谱芯片

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CREB3对结直肠癌转移的影响及其机制

CREB3对结直肠癌转移的影响及其机制

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作者：李沛瑶中南大学

学位级别：硕士

背景：结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者的死亡率很高,而转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。目前没有任何测试或生物标志物能精确地预测肿瘤的侵袭和转移。因此,提高预测侵袭转移的手段是十分有必要的,鉴定生物标志物,监测结直... 详细信息

背景：结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者的死亡率很高,而转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。目前没有任何测试或生物标志物能精确地预测肿瘤的侵袭和转移。因此,提高预测侵袭转移的手段是十分有必要的,鉴定生物标志物,监测结直肠癌的转移将使医疗个性化,提高癌症患者的存活率。CREB3（也称Luman或LZIP）是CREB3亚家族转录因子的原型,是一种bZIP转录因子,它不仅参与了内质网应激和未折叠蛋白反应,而且还在许多生物学过程,包括细胞迁移以及癌变中起到至关重要的作用。CREB3能与转录共激活子HCF1,丙型肝炎病毒核心蛋白,CC趋化因子受体,和树突状细胞特异性跨膜蛋白相互作用。还有研究指出CREB3可能与乳腺癌细胞、宫颈癌细胞的转移密切相关。本实验旨在研究与结直肠癌浸润转移相关的生物标志物,提高预测结直肠癌侵袭转移的手段。方法：（1）用表达谱芯片检测结直肠癌FFPE组织中mRNA表达谱的差异。（2）采用原位杂交技术和免疫组织化学技术对芯片结果进行验证。（3）QPCR检测三株结直肠癌细胞（分别为HCT116、SW620和SW480）中CREB3的表达。（4） Transwell法检测三株结直肠癌细胞的迁移能力。（5）免疫细胞化学对SW480细胞中的CREB3进行定位。（6） QPCR法检测三株结直肠癌细胞中转移相关基因的表达如：TWIST1、β-catenin、MMP9和MMP2。（7）siRNA法瞬时干扰SW480细胞中的CREB3后,QPCR检测转移相关基因（TWIST1、β-catenin、 MMP9、MMP2）的表达。结果：（1）芯片结果显示,有远处转移结直肠癌患者的转移癌灶中,CREB3的表达明显高于其原发癌灶;在复发患者的复发癌灶中,CREB3的表达明显高于其原发癌灶。（2）原位杂交技术和免疫组织化学结果显示转移组患者原发灶和癌旁组织中的CREB3表达明显高于无转移组患者的原发灶和癌旁组织。（3） QPCR结果显示三株结直肠癌细胞中SW480细胞中CREB3的表达最高。（4）三株结直肠癌细胞中SW480细胞的迁移能力最强。（5）免疫细胞化学结果显示在SW480细胞中CREB3主要表达在胞浆,少量表达在胞核。（6） QPCR显示三株结直肠癌细胞中与转移相关的几个基因如β-catenin、MMP9和MMP2在SW480细胞中的表达最高,趋势与CREB3相同。（7）瞬时干扰SW480细胞中的CREB3后,QPCR结果显示MMP2的表达显著下降,Twist1、β-catenin和MMP9的表达无明显变化。结论：CREB3的表达可能与结直肠癌的转移相关,CREB3可能通过MMP2的表达促进结直肠癌细胞的迁移。

关键词：结直肠癌表达谱芯片 CREB3 转移

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低钠盐对胰岛素信号通路基因网络状态的影响

低钠盐对胰岛素信号通路基因网络状态的影响

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作者：常丽君天津科技大学

学位级别：硕士

随着人类基因组测序工作的完成,基因与饮食的关系已经成为营养学研究的新热点。在流行病学研究中,发现高血压与肥胖均属于多基因疾病,且都存在胰岛素抵抗,即胰岛素信号通路传导异常。限盐作为有效的非药物手段,在控制血压、肥胖及缓减... 详细信息

随着人类基因组测序工作的完成,基因与饮食的关系已经成为营养学研究的新热点。在流行病学研究中,发现高血压与肥胖均属于多基因疾病,且都存在胰岛素抵抗,即胰岛素信号通路传导异常。限盐作为有效的非药物手段,在控制血压、肥胖及缓减胰岛素抵抗方面有着积极作用。基于以上的研究,本论文应用基因芯片技术,从分子水平,揭示低钠盐饮食对胰岛素信号通路相关基因表达情况的影响,并建立基因间相互关联的局部网络。论文中所用的低钠盐由川崎食品有限公司提供,其NaCl含量为50%左右。在监督下,用这种盐代替普通食盐,针对正常人群、高血压人群、以及高血压并发肥胖人群,共9人,进行12周的实验。采集受试者食用前后血样,进行芯片实验。本论文通过生物信息统计,确定血液中表达的胰岛素信号通路相关基因共114个。针对高血压人群与正常人群,应用博奥生物有限公司的22K人类全基因组芯片。主要的变化基因Akt2、Akt3、GSK3、GCK、HK2、以及SOS参与了相关通路：PI-3K/Akt Signaling Pathway, Focal Adhesion, T Cell Receptor Signaling Pathway, JAK-STAT Signaling Pathway。针对高血压并发肥胖患者人群,应用康成生物工程公司针对性更强的芯片,仅对114个胰岛素信号通路相关基因进行检测。由表达明显变化的基因建立基因局部网络,主要涉及到的通路有：PI-3K/Akt Signaling Pathway, Focal Adhesion,B Cell Reception Signaling Pathway, long-term depression。通过对这些基因局域网络的分析,发现这些基因表达的变化对胰岛素信号相关通路的传导有一定改善作用,调控细胞的活性,改善葡萄糖的摄取和运输,在一定程度上能缓减胰岛素抵抗。希望本论文能为限盐研究提供新的思路和线索。

关键词：胰岛素抵抗低钠盐胰岛素信号通路表达谱芯片局部网络

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