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空间环境诱导秀丽隐杆线虫关键基因模块及其转录因子的表达调控网络分析

空间环境诱导秀丽隐杆线虫关键基因模块及其转录因子的表达调控网...

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作者：包成彧大连海事大学

学位级别：硕士

空间飞行任务下航天员不可避免的暴露于空间环境中,其中空间辐射和微重力作为空间环境中的两个最重要的独特环境因素,可导致航天员产生多种健康风险,被认为是制约人类长期在轨和深空探测工程主要因素。秀丽隐杆线虫因其具有易培养、个... 详细信息

空间飞行任务下航天员不可避免的暴露于空间环境中,其中空间辐射和微重力作为空间环境中的两个最重要的独特环境因素,可导致航天员产生多种健康风险,被认为是制约人类长期在轨和深空探测工程主要因素。秀丽隐杆线虫因其具有易培养、个体小、与人同源性高等优点,多次作为模式生物被用于空间飞行实验,并基于此获得了一系列的转录组学数据,为进一步探索空间环境生物学效应及其调控机制提供重要的数据源。然而,目前国内外的研究对于空间条件下的秀丽隐杆线虫转录组数据分析和挖掘明显不足。因此,本研究旨在利用多种空间飞行条件下的秀丽隐杆线虫转录组数据,深入挖掘空间环境诱导的线虫关键基因模块,并预测其转录因子,分析关键模块中的基因表达及其与转录因子间的表达调控网络。经过研究,本文获得如下结果:(1)分析并获得了不同空间飞行条件下秀丽隐杆线虫的差异表达基因,主要包括:4天空间飞行条件下上调382个基因、下调5174个基因,8天空间飞行条件下上调360个基因、下调797个基因,10天空间飞行的条件下上调454个基因、下调1330个基因,6个月空间飞行条件下上调2719个基因、下调1758个基因。进一步,分析了不同空间飞行条件下差异表达基因的关系,发现32个基因在所有的空间飞行组均发生了显著性的变化。通过对这32个交集基因进行ss GSEA富集分析,获得了6个显著的KEGG通路,主要包括长寿调节通路、内质网蛋白质加工、内吞作用等,以及43个GO生物学过程,主要包括神经系统发育、蛋白质折叠、寿命和衰老、防御反应、对外界刺激的反应、细胞通讯等。进一步,我们对不同空间飞行条件下的所有上调和下调基因分别进行富集分析,通过对这些富集结果进行网络分析,获得了空间飞行条件下秀丽隐杆线虫中影响显著的关键基因模块,主要包括防御反应模块、错误折叠蛋白反应模块、自噬模块、DNA修复模块、长寿调节模块、生殖模块和胚胎发育模块等。(2)利用聚类和蛋白互作网络分析方法对关键模块中的基因分别进行表达模式和连接度分析,筛选具有重要功能的基因。研究表明,这些关键基因模块中的基因表达在不同空间飞行条件下具有较好的聚类效果,这说明了这些基因具有明显的时间依赖性。以DNA修复模块为例,我们发现随着空间飞行时间的延长,该模块中的基因表达表现出了显著地的增加趋势。此外,我们还发现在空间飞行条件下,防御反应模块的关键基因为lys-1和sta-1,错误折叠蛋白反应模块的关键基因为F44E5.4、hsp-16.41、hsp-16.48、hsp-16.11和hsp-70,自噬模块的关键基因为C35E7.5、vet-6、sepa-1、sdz-30和bec-1,DNA修复模块的关键基因为F10C2.4、pcn-1、crn-1、pole-1和rad-51,长寿调节模块的关键基因为hsp-70和daf-2,生殖模块的关键基因为cyb-2.2、tra-1和vab-3,胚胎发育模块的关键基因为rad-51和ima-2。对调控关键模块基因表达的转录因子进行预测。结果显示,alg-1、pha-4、blmp-1、csr-1、dpl-1、skn-1等转录因子可能参与调控了多个关键模块中的基因表达,据此我们建立转录因子与关键模块基因表达调控网络。总之,本研究分析并获得了不同空间飞行条件下秀丽隐杆线虫的差异表达基因及所属关键基因模块,主要包括防御反应模块、错误折叠蛋白反应模块、自噬模块、DNA修复模块、长寿调节模块、生殖模块和胚胎发育模块;进一步,我们筛选并获得了这些关键模块中的重要功能基因,并分析了这些模块基因的表达模式;此外,我们还对这些关键模块中的基因进行了转录因子的预测与表达分析,获得了相应的表达调控网络。本研究为空间飞行条件下的线虫生物学效应及机制研究提供了重要的参考,以及为航天员健康风险以及生物医学防护提供重要的技术支撑。

关键词：空间环境空间辐射微重力秀丽隐杆线虫转录因子表达调控网络

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猪脂肪合成过程分子调控网络的构建及相关基因转录水平的表达分析

猪脂肪合成过程分子调控网络的构建及相关基因转录水平的表达分析

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作者：陶隽河北农业大学

学位级别：硕士

对猪脂肪沉积性状候选基因的研究多集中于基因多态性的研究，但由于脂肪沉积性状是数量性状，受控于多基因，各基因在不同时空状态下又受到多级上游基因的调控。因此，研究单个基因并不能全面解释脂肪沉积性状的遗传机理，挖掘影响脂肪... 详细信息

对猪脂肪沉积性状候选基因的研究多集中于基因多态性的研究，但由于脂肪沉积性状是数量性状，受控于多基因，各基因在不同时空状态下又受到多级上游基因的调控。因此，研究单个基因并不能全面解释脂肪沉积性状的遗传机理，挖掘影响脂肪沉积的基因，研究诸基因的表达关系成为研究脂肪沉积的关键。本研究基于文献挖掘的方法，以脂肪合成的生物化学过程为基础，确定脂肪酸合成、脂肪酸链的延长和去饱和、三酰甘油的合成三个阶段的催化反应酶及其编码基因，以及已见报道的对上述基因有调控作用的基因，以此构建脂肪合成的分子表达调控网络。本文构建出了以PPARγ、LXRα、SREBP-1、ChREBP基因为主干的调控网络。网络中有多条通路可调控FASN、ACC、DGAT、GPAT、ACSL等脂肪合成催化酶的编码基因。包括PPARγ→LXRα→SREBP-1→FASN（ACC、Thrsp、S14R）通路，PPARγ→LXRα→ChREBP→FASN（ME、SCD1、Thrsp、ACC、FASN、S14R）通路及其他调控通路。FASN、ACC、DGAT、GPAT、ACSL等催化酶基因处于通路的最下游位置。研究过程中发现，猪脂肪酸链延长过程催化酶的基因调控资料还较少，通过染色体定位结果显示，这些酶的基因位于脂肪合成基因分布相对集中的染色体上，可对这些基因多加以研究，挖掘有利于分子育种的标记基因。本研究对基因FASN、ACACA、Thrsp、ACSL1等脂肪合成的关键基因进行生物信息学分析，通过蛋白质二级结构预测，信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、结构域等的预测，为进一步研究提供参考依据。为验证所构建网络的正确性，本研究通过荧光定量PCR对ACACA、Thrsp、ACSL1基因在肝脏、大网膜、背最长肌、肾周、背膘5个组织中的mRNA表达量进行分析，结果显示3个基因的表达趋势表现出很高的一致性，且3个基因存在较强的相关性。大网膜中3个基因各自之间相关性极显著;背最长肌中Thrsp基因与ACSL1基因表达量显著相关;肾周脂肪中Thrsp与ACSL1基因表达量相关极显著。这与构建的网络中Thrsp对ACC的表达正向调控作用一致。相关性的存在是转录调控机制研究的基础，通过本文的研究，可继续进行基因启动子区的研究、转录因子结合位点的研究、DNA和转录因子结合分析等一系列研究，以确定详细的转录调控机制。

关键词：脂肪沉积表达调控网络生物信息学转录水平表达

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重构酶系及转录调控网络增强草酸青霉纤维素酶生产以及糖化分解能力研究

重构酶系及转录调控网络增强草酸青霉纤维素酶生产以及糖化分解能...

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作者：毛怡然山东大学

学位级别：硕士

以木质纤维素生物转化产乙醇为代表的生物燃料的发展,不仅对我国应对能源危机有重要作用,同时其研究和实际应用也对环境保护和社会发展具有多方面长期有益影响,因此,对其开发利用已成为国内外研究的热点问题。在木质纤维素生物转化过程... 详细信息

以木质纤维素生物转化产乙醇为代表的生物燃料的发展,不仅对我国应对能源危机有重要作用,同时其研究和实际应用也对环境保护和社会发展具有多方面长期有益影响,因此,对其开发利用已成为国内外研究的热点问题。在木质纤维素生物转化过程中,利用纤维素酶将木质纤维素降解为葡萄糖是关键步骤。但目前较高的用酶成本极大地限制了生物转化工业的大规模化生产。因此,通过构建高效产酶且酶系优良的纤维素酶生产菌株,以降低纤维素酶生产成本并有效减少转化过程中的纤维素酶用量,对于降低纤维素乙醇生产成本,促进其工业化生产具有重要意义,也是目前国内外研究的重要课题。草酸青霉114-2是本实验室筛选得到,有知识产权的纤维素酶生产菌株,与其它产纤维素酶菌株相比,其酶系丰富,特别是具有更完整的半纤维素酶系。更加适用于对成分复杂的木质纤维素原料的水解。经过长期研究,目前课题组在草酸青霉的基因组学和蛋白质组学、主要胞外分泌调控因子、胞外酶系构成以及酶作用机制等方面都有了较为深入的研究和了解。通过对菌株的一系列基因工程改造,先后获得了纤维素酶生产能力和水解底物能力提高的多株优良菌株如JU-A10、RE-7等。在此基础上,为进一步提高菌株分泌纤维素酶能力和对底物的降解能力,本论文综合已有知识,从多方面对草酸青霉进行了系统改造,通过重构调控网络增强菌株胞外纤维素酶分泌能力、通过调整酶系构成增强纤维素酶对底物的降解能力,进一步结合诱变筛选,获得了多株产酶能力和水解纤维素底物能力高的优良纤维素酶生产菌株。论文的主要研究内容和研究结果如下:1.草酸青霉纤维素酶系改造和调控网络重构,构建了一系列纤维素酶生产能力和对不同纤维素底物水解能力提高的优良菌株。以实验室已有的一株纤维素酶高产菌株RE-7为出发菌株,通过替换本源CBH为里氏木霉来源CBH、敲除bgl2同时过表达EG、黑曲霉来源BGL1和Swo（swollenin）等,筛选得到重组菌株TEBS-1和TEBS-2;通过替换CBH、敲除bgl2同时过表达BGL1、嵌合转录因子CXC,筛选得到TBgcB-2。结果表明,上述构建的重组菌株的胞外蛋白分泌量、FPA及各项主要纤维素酶活如纤维素内切酶酶活、纤维素外切酶酶活等都有显著提升,其中TBgcB-2的滤纸酶活达到了 9.89±1.04 IU/ml,是出发菌株RE-7粗酶液滤纸酶活的约2.15倍。利用TEBS-2粗酶液水解不同预处理后的玉米秸秆原料,包括APCS（亚硫酸铵预处理玉米秸秆）、NPCS（NaOH预处理玉米秸秆）、SPCS（稀硫酸预处理玉米秸秆）以及LHW（高温热水预处理玉米秸秆）,水解48 h时纤维素转化率分别是出发菌株RE-7的1.5倍、1.67倍、1.48倍和1.57倍,表明重组菌株纤维素酶系的水解效率大幅度提高。基于上述研究结果和实验室前期已有研究基础,为减少筛选标记对遗传改造的限制,以实验室已有尿嘧啶缺陷型草酸青霉M12为出发株,敲除bgl2的同时过表达黑曲霉BGL1和嵌合转录因子CXC、敲除阻遏因子CreA同时过表达突变的转录激活因子xlnRA871v、敲除本源CBH同时过表达里氏木霉CBH,经过上述三步改造后,得到重组菌株CXT。研究表明,CXT粗酶液的滤纸酶活是RE-7的约2.39倍,纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡萄糖苷酶酶活也都较RE-7有较大提高。胞外蛋白和酶活分析说明通过重构草酸青霉调控网络也有效地提高了工程菌株的蛋白分泌量。利用CXT粗酶液水解NPCS、SPCS和LHW等不同方法预处理后的玉米秸秆原料,结果表明,与菌株RE-7的粗酶液相比,对底物的水解效率显著提升,与商业纤维素酶相比,水解后葡聚糖转化率基本类似,显示了良好的应用前景。由于CXT菌株的滤纸酶活和水解能力都较高,并且只经过三步改造,可以作为后续继续对草酸青霉进行遗传操作改造的优质出发菌株。2.半纤维素相关降解酶类基因的表达及草酸青霉半纤维素酶系改造通过对糖化水解残渣进行分析,将CXT菌株中可能缺少的多个半纤维素酶组分在毕赤酵母中进行了表达,包括草酸青霉来源的内切-β-1,4-木聚糖酶、α-葡萄糖醛酸酶/β-氨基葡萄糖苷酶,黑曲霉来源的α-木糖苷酶,以及里氏木霉来源的α-葡萄糖醛酸酶,分离纯化得到纯酶组分并研究了各自的酶学性质。结合课题组已有半纤维素酶的研究,获得了 8种纯化的半纤维素酶类,分别研究了其添加对CXT粗酶液水解不同预处理玉米秸秆过程中葡聚糖转化率的影响。结果表明,其中,β-木糖苷酶Xyl3A、α-木糖苷酶、多功能酶Gax3A（同时具有β-葡萄糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和木糖苷酶酶酶活）的添加在一定程度上都对CXT粗酶液糖化能力有促进作用。原因可能是这三种酶组分的添加能够有效水解木寡糖,降低其对水解的抑制作用,其中,多功能酶Gax3A的添加还可以释放侧链阿拉伯糖基团,增加纤维素酶与底物的可

关键词：草酸青霉转录因子纤维素酶酶系改造表达调控网络酶解糖化

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