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睾丸酮丛毛单胞菌3β/17β-羟基类固醇脱氢酶的表达调控分析

睾丸酮丛毛单胞菌3β/17β-羟基类固醇脱氢酶的表达调控分析

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作者：王保学长春理工大学

学位级别：硕士

甾体激素是环境中存在的一类重要污染物,甾体激素的生物型降解和降解基因的表达调控分析日渐受到科研工作者的重视。睾丸酮丛毛单胞菌是一种利用甾体激素作为碳源和能源的革兰氏阴性细菌。本文利用酶联吸附免疫实验、基因敲除技术、高... 详细信息

甾体激素是环境中存在的一类重要污染物,甾体激素的生物型降解和降解基因的表达调控分析日渐受到科研工作者的重视。睾丸酮丛毛单胞菌是一种利用甾体激素作为碳源和能源的革兰氏阴性细菌。本文利用酶联吸附免疫实验、基因敲除技术、高效液相色谱、环化RT-PCR技术、反向PCR技术、质粒共转化技术等对睾丸酮丛毛单胞菌中3β/17p-羟基类固醇脱氢酶的诱导表达、功能进行分析,以及转录起始位点、表达调控机理进行研究。在培养基中分别加入等量的17β-雌二醇、雌三醇、胆固醇、睾丸酮进行睾丸酮丛毛单胞菌的培养,ELISA结果揭示3β/17β-HSD受甾体激素诱导,尤其睾丸酮对3β/17β-HSD诱导效应显著,高于无甾体激素添加表达量的45%。通过首次构建3β/17β-HSD基因缺失突变菌株研究发现：3β/17β-HSD对胆固醇、睾丸酮的利用起重要作用,3β/17β-HSD基因缺失突变菌株对胆固醇的降解功能丧失,对睾丸酮的利用效率降低95%以上;同时发现3β/17β-HSD对甾体激素作用靶点是C3上的羰基。利用环化Rr-PCR的方法研究发现3β/17β-HSD基因mRNA全长不唯一,但基因转录起始位点基本集中在基因上游-143bp的位置,可能与细菌自身的代谢机制相关。LysR转录调控家族是一类转录调控因子。采用质粒共转化研究3β/17β-HSD基因上游一个未知LysR蛋白对3β/17β-HSD的转录表达调控研究发现：在无外源激素诱导条件下,含有LysR基因的菌株比不含LysR基因的菌株3β/17β-HSD的表达量提高24%：同时在含有LysR基因的菌株中33β/17β-HSD的表达量随甾体激素的种类不同而不同,但均低于无激素添加的表达量,分析认为该LysR蛋白对3β/17β-HSD起到正调控的作用。

关键词：睾丸酮丛毛单胞菌 3β/17β-羟基类固醇脱氢酶表达调控分析

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黄原胶降解基因簇的基因工程研究

黄原胶降解基因簇的基因工程研究

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作者：李鹤大连工业大学

学位级别：硕士

黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的水溶性多糖,对黄原胶分子结构进行改造,有望为生物医药及食品工业等领域提供新型材料,有着很高的应用价值和发展前景。目前,黄原胶生物降解途径尚未得到完全阐明,阻碍了我... 详细信息

黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的水溶性多糖,对黄原胶分子结构进行改造,有望为生物医药及食品工业等领域提供新型材料,有着很高的应用价值和发展前景。目前,黄原胶生物降解途径尚未得到完全阐明,阻碍了我们对其进行理性改造的进程。Microbacterium ***11能够利用黄原胶为唯一碳源进行生长,是一株能够有效降解黄原胶的微细菌。前期的基因组数据分析结果表明,XT11的基因组中存在与黄原胶生物降解密切相关的基因簇,阐明该基因簇的结构及表达调控特性,有利于解析黄原胶生物降解的分子机理。因此,本课题以Microbacterium ***11为出发菌株,利用转化辅助重组技术(transformation-associated recombination,TAR),从XT11菌株的基因组DNA中成功钓取黄原胶降解基因簇(Cluster)。该基因簇大小约为17kb,包含有黄原胶内切酶编码基因、葡萄糖苷酶编码基因、甘露糖苷酶编码基因、黄原胶裂解酶编码基因及一个转录调控元件和一个ABC型糖转运系统编码基因。本工作利用酿酒酵母高效的同源重组机制、并借助GFP报告基因优化筛选效率,成功地将该基因簇连接到枯草-大肠穿梭表达质粒pAX01,获得携带黄原胶降解基因簇的重组表达质粒pALHC。重组表达质粒pALHC的构建为后续的基因簇异源表达及结构解析研究打下了基础。随后,本工作利用反转录技术和荧光定量PCR技术考察了黄原胶降解基因簇内各基因元件转录及表达情况。结果表明,黄原胶内切酶编码基因作为一个独立的转录单元进行表达调控,而其他四个蛋白编码基因(ABC型糖转运系统编码基因、葡萄糖苷酶编码基因、甘露糖苷酶编码基因、黄原胶裂解酶编码基因)共属一个转录单元。该结果说明黄原胶降解基因簇可能受到多种反式作用因子的调控。基因表达水平研究结果表明,相比以葡萄糖为碳源生长,XT11在以黄原胶为唯一碳源生长时,黄原胶降解基因簇内各基因的表达水平均上升,然而在后一个转录单元中,甘露糖苷酶编码基因前可能存在一个内源性的启动子,导致其表达量上升。最后,基于降解基因簇内基因转录及表达结果,分别利用启动子预测网站Softberry和MEME suite对基因簇内可能的启动子序列和调节基序进行预测。结果显示,分别在黄原胶内切酶编码基因上游、ABC型糖转运系统编码基因上游和甘露糖苷酶编码基因上游预测出三个启动子,其共有的调节基序为TCNATNCT。通过电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)尝试钓取参与基因簇各元件表达调控的反式作用因子。回收结合蛋白并利用液质联用仪分析得到6种可能的调控蛋白,分别为单链DNA结合蛋白(LX1-1GL000807)、假定蛋白,转录调节因子K(LX1-1GL000216)、RpiR家族转录调节因子(LX1-1GL000455)、冷激蛋白,DNA结合蛋白(LX1-1GL001153)、假定蛋白,DNA介导的RNA聚合酶,σ亚基(LX1-1GL000256)、冷激蛋白,DNA结合蛋白(LX1-1GL000925)。本课题的研究成果为后续黄原胶降解途径解析和黄原胶分子理性改造打下基础。

关键词：黄原胶生物降解 Microbacterium sp.XT11 黄原胶降解基因簇表达调控分析

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