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表皮黑素细胞纯化、应激及重编程的研究

表皮黑素细胞纯化、应激及重编程的研究

作者：李娣苏州大学

学位级别：硕士

目的:(1)比较不同包被材料、不同培养条件对黑素细胞(Melanocytes,MCs)的纯化作用。探索方便、高效的MCs纯化的方法。(2)通过反复多次长时间胰酶(Long-term trypsinization,LTT)处理,获取表皮来源的应激MCs,即黑素细胞球(Melanocyte sph... 详细信息

目的:(1)比较不同包被材料、不同培养条件对黑素细胞(Melanocytes,MCs)的纯化作用。探索方便、高效的MCs纯化的方法。(2)通过反复多次长时间胰酶(Long-term trypsinization,LTT)处理,获取表皮来源的应激MCs,即黑素细胞球(Melanocyte spheroids,MS)。探索MS在免疫荧光染色、免疫组化、亚细胞结构及致瘤性等方面的生物学特性。(3)采用三因子及四因子转染方法制备MCs来源的诱导多功能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs),观察其多能性标记及外胚层分化的潜能。方法:(1)将包皮组织、包皮的表皮组织及消化所得的细胞悬液,分别培养于层粘连蛋白或基质胶包被的培养板中,传代时进行差别胰酶处理,传代后加入G418或5-BrdU,通过MCs的标记性抗体HMB45荧光染色,观察MCs纯度。(2)获取表皮黑素细胞,当达到70-80%融合时,胰酶消化2h,存活的细胞用M254培养基重悬,接种在24孔板内;继续培养1周后,胰酶消化4h后重种;继续培养1周左右,当细胞达到80-90%融合时,胰酶消化6h,倒置显微镜下观察其成聚合状态。(3)用四因子(Sox2,Oct4,Klf-4,c-Myc)或三因子(Oct4,Klf-4,c-Myc)的慢病毒载体转染纯化或应激获得的MCs,对三因子及四因子生成的克隆进行干细胞标记相关抗体的免疫荧光染色及外胚层分化。结果:(1)原代培养中,细胞悬液比组织块获得细胞更多更快,单纯表皮比带真皮的组织块更早有细胞迁移并增殖;层粘连蛋白包被比基质胶包被更有利于MCs生长;差别胰酶处理以及加入一定浓度的G418或5-BrdU都可以纯化MCs,但后两种药物浓度较大时对细胞损伤明显。(2)多次LTT处理后获取的MCs,短期培养呈聚合状态,机械挑取MS至24孔板,单层MCs从细胞球边缘爬出,且MCs活性好,纯度高。(3)三因子及四因子转染都能成功,但是相比三因子转染,四因子转染形成的克隆多,并且克隆呈聚合状态。原代克隆干细胞相关抗体染色Sox2,Oct4阳性,代表神经元标记的相关染色不明显。结论:(1)采用层粘连蛋白包被板培养包皮来源的细胞悬液,传代时采用差别胰酶处理,传代后加小剂量的G418或5-BrdU,有利于MCs纯化,而不影响其生长。(2)MS免疫组化染色显示HMB45阳性,将MS皮下注射到小鼠大腿外侧,4个月后无黑素瘤形成,MS为细胞移植治疗白癜风提供了有望的前景。(3)三因子及四因子都能成功转染成iPSCs,表达大部分干细胞标记,体外诱导就外胚层诱导而言,只有少量的细胞诱导分化为神经元样细胞,nestin和b-III tubulin染色阳性。

关键词：表皮黑素细胞纯化黑素细胞球长时间胰酶消化诱导多功能干细胞重编程

308nm激光联合胡椒碱对表皮黑素细胞中黑素合成及酪氨酸相关蛋白水平的影响

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中国皮肤性病学杂志 2016年第4期30卷 345-348,375页

作者：吴一菲曹萍王晓川关真陈伟刘畅云南省第一人民医院皮肤性病科云南昆明650032

目的研究308nm激光联合胡椒碱对表皮黑素细胞中黑素合成及酪氨酸相关蛋白水平的影响,初步探讨不同分组对黑素合成的作用机制。方法培养的表皮黑素细胞分别以308nm激光联合胡椒碱(联合干预组)、308nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白... 详细信息

目的研究308nm激光联合胡椒碱对表皮黑素细胞中黑素合成及酪氨酸相关蛋白水平的影响,初步探讨不同分组对黑素合成的作用机制。方法培养的表皮黑素细胞分别以308nm激光联合胡椒碱(联合干预组)、308nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白对照组作用24h,72h及120h后,测定细胞黑素含量及酪氨酸相关蛋白(TRP-1,TRP-2)活性(激光共聚焦荧光定量分析法)。结果联合干预组、308nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组均不同程度促进黑素含量及TRP-1,TRP-2活性的增高。其中以联合干预组促进作用最强。结论 308nm激光联合胡椒碱有明显促进表皮黑素细胞黑素合成作用。

关键词：黑素生成 308nm激光胡椒碱表皮黑素细胞

表皮黑素细胞专用培养基组分与细胞外信号调节激酶蛋白磷酸化关系初步观察

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中华移植杂志（电子版） 2010年第1期4卷 34-36页

作者：周妙妮许文傅丽芳洪为松关翠萍许爱娥杭州市第三人民医院皮肤科 310009

目的了解表皮黑素细胞专用培养基HU16中维持细胞生长的主要物质人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FBS和环腺苷酸激动剂与细胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白磷酸化的关系。方法从环切包皮原代培养人表皮黑素细胞,用western blot检测去b... 详细信息

目的了解表皮黑素细胞专用培养基HU16中维持细胞生长的主要物质人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FBS和环腺苷酸激动剂与细胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白磷酸化的关系。方法从环切包皮原代培养人表皮黑素细胞,用western blot检测去bFGF、去FBS以及去环腺苷酸激动剂培养基培养后ERK1/2蛋白磷酸化水平的改变。结果去bFGF和去FBS处理后,表皮黑素细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平明显下降(P表皮黑素细胞中ERK1/2蛋白的磷酸化水平。

关键词：表皮黑素细胞原代培养细胞外信号调节激酶磷酸化碱性成纤维细胞生长因子胎牛血清

研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用

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中国医药指南 2014年第12期12卷 66-67页

作者：许小标解士海杨观招广东省惠州市皮肤病医院广东惠州516001

目的研究分析表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系的建立,以及相互作用。方法用胰酶融化游离毛囊与包皮的表皮,获得纯度角度高的角质形成细胞与黑素细胞,第三代毛囊角质形成细胞在6孔板中接种,2 d以后按照表皮黑素细胞与... 详细信息

目的研究分析表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系的建立,以及相互作用。方法用胰酶融化游离毛囊与包皮的表皮,获得纯度角度高的角质形成细胞与黑素细胞,第三代毛囊角质形成细胞在6孔板中接种,2 d以后按照表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞之间的比例,按照1∶2、1∶10、1∶20的比例接种黑素细胞,其中在1∶10的比例中,加入-黑素细胞刺激素,在干预6 d以后,用NKI/beteb作一抗。结果以1∶10的接种比例,很符合表皮基底层的黑素细胞与角质形成细胞比例;但是在1∶2情况下可获得数量多的表皮黑素细胞。而在1∶20情况下可以发现角质细胞、黑素细胞之间的联系。结论表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系下,非常适合用于人色素系统方面的研究。

关键词：表皮黑素细胞毛囊角质细胞黑素细胞

人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和鼠黑素瘤细胞的原子力显微镜观察

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临床皮肤科杂志 2003年第11期32卷 631-634页

作者：张汝芝朱文元夏明玉冯岩南京医科大学第一附属医院皮肤科江苏南京210029 南京医科大学电镜室江苏南京210029 南京大学物理系江苏南京210029

目的:观察培养的人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和S91鼠黑素瘤细胞的形态结构。方法:培养并纯化来自正常人包皮的黑素细胞以及来自毛囊的无色素黑素细胞,同时复苏S91细胞株,传代后接种到内置云母片的培养板中,细胞贴附到云母片上... 详细信息

目的:观察培养的人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和S91鼠黑素瘤细胞的形态结构。方法:培养并纯化来自正常人包皮的黑素细胞以及来自毛囊的无色素黑素细胞,同时复苏S91细胞株,传代后接种到内置云母片的培养板中,细胞贴附到云母片上后固定,用原子力显微镜扫描观察。结果:正常人表皮黑素细胞有3级分支,在主干及分支的顶端和侧缘可见膨出的球形结构。鼠黑素瘤细胞仅有很短的2级分支,在2级树突近端可见黑素小体。毛囊无色素黑素细胞只有1级树突,并只在树突近端有少数黑素小体。结论:表皮黑素细胞在形态上比黑素瘤细胞、毛囊无色素黑素细胞更成熟,有更多的黑素颗粒从树突的顶端和侧缘以胞吐的形式被输出。

关键词：表皮黑素细胞无色素黑素细胞鼠黑素瘤细胞原子力显微镜

Nrf2通路在人表皮黑素细胞和角质形成细胞的光氧化应激反应中的意义

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中华皮肤科杂志 2014年第5期47卷 378-378页

作者：陈旭孔佩慧甄雅贤

为了抵御有害活性氧簇的生成，细胞应对内源性代谢或环境应激压力的主要策略是诱导产生抗氧化剂和（或）第二相解毒酶。存在一部分的第二相酶专门针对抗氧化应激反应。例如，NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO-1）能够使反应性醌失活；血... 详细信息

为了抵御有害活性氧簇的生成，细胞应对内源性代谢或环境应激压力的主要策略是诱导产生抗氧化剂和（或）第二相解毒酶。存在一部分的第二相酶专门针对抗氧化应激反应。例如，NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO-1）能够使反应性醌失活；血红蛋白氧化酶1（HO-1）能够产生有效的抗氧化剂胆红素，刺激铁蛋白生成，减少游离铁含量，后者是Fenton反应的催化剂；r-谷酰基半胱氨酸合成酶（GCL）调控谷胱甘肽的生产，后者是主要的内源性巯基抗氧化剂。编码第二相酶基因的基础表达和诱导是由抗氧化剂应答元件（ARE）介导的。ARE是转录调节这些基因的顺式作用增强子序列，以维持细胞的氧化还原状态并防止氧化性损伤的发生。

关键词：角质形成细胞氧化应激反应 NAD(P)H 醌氧化还原酶表皮黑素细胞 Nrf2 Fenton反应抗氧化剂通路

强脉冲荧光不同波长对豚鼠皮肤色素和表皮黑素细胞影响的实验观察

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强脉冲荧光不同波长对豚鼠皮肤色素和表皮黑素细胞影响的实验观察

驱虫斑鸠菊黄酮促人表皮黑素细胞黑素合成及其机制的研究

第4届中国美容与整形医师大会

作者：杨宁李大铁谷琪陈康龙际杨琴华鹏温州医学院附属第一医院烧伤整形科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科遵义医学院附属医院美容医院整形美容科

目的评价强脉冲荧光（FPL）三种不同波长对豚鼠皮肤色素及表皮黑素细胞的影响。方法用相同能量（34J/cm2）的535nm滤光片（脉宽36.2ms）、580nm滤光片（脉宽46.8ms）、615nm滤光片（脉宽62.7ms）分别照射三组豚鼠,然后在照射前、照射后... 详细信息

目的评价强脉冲荧光（FPL）三种不同波长对豚鼠皮肤色素及表皮黑素细胞的影响。方法用相同能量（34J/cm2）的535nm滤光片（脉宽36.2ms）、580nm滤光片（脉宽46.8ms）、615nm滤光片（脉宽62.7ms）分别照射三组豚鼠,然后在照射前、照射后不同阶段取材,通过HE、Lillie亚铁反应法、透射电镜观察皮肤色素及表皮黑素细胞的变化。结果随着照射次数增加和时间的推移,色素逐渐消退,对每次照射后的三组色素变化作统计学比较,发现535nm祛除色素效果优于另外两组（P＜0.05）,并且透射电镜观察该组黑素细胞的细胞器变性明显,但细胞核和细胞膜完整。讨论强脉冲荧光的较短波长可用于祛除表皮色素沉着,且效果优于长波长,黑素细胞并未遭到彻底破坏,但细胞器变性明显,可能会抑制黑素合成。

关键词：强脉冲荧光皮肤色素表皮黑素细胞透射电镜

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国美容医学 2008年第4期17卷 524-526页

作者：马慧军訾绍霞李铀刘雯王毅侠赵广中国人民解放军皮肤病研究所空军总医院皮肤科北京100036 首都医科大学宣武医院皮肤性病科北京100053

目的:观察驱虫斑鸠菊黄酮对体外培养的人表皮黑素细胞(MC)黑素合成和酪氨酸酶活性的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:噻唑兰比色法(MTT)测定药物对细胞增殖率的影响,选择高、中、低3种浓度(30、10、3μg/ml)的驱虫斑鸠菊黄酮作... 详细信息

目的:观察驱虫斑鸠菊黄酮对体外培养的人表皮黑素细胞(MC)黑素合成和酪氨酸酶活性的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:噻唑兰比色法(MTT)测定药物对细胞增殖率的影响,选择高、中、低3种浓度(30、10、3μg/ml)的驱虫斑鸠菊黄酮作用体外培养的人表皮黑素细胞,观察对黑素细胞的形态、酪氨酸酶活性、黑素含量的影响。免疫印迹法测定药物作用前后MC酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)蛋白表达的变化。结果:≥90μg/ml驱虫斑鸠菊黄酮可明显抑制MC的增殖;试验浓度范围内可明显促进MC黑素合成和酪氨酸酶活性增加,并以浓度依赖方式促进TRP-1的蛋白表达,但对TYR、TRP-2的表达没有影响。结论:驱虫斑鸠菊黄酮在体外能直接刺激表皮MC黑素合成,上述变化可能通过促进TRP-1的蛋白表达和TYR的翻译后修饰作用来完成。

关键词：驱虫斑鸠菊黄酮表皮黑素细胞黑素合成免疫印迹

血红素氧合酶-1可通过Nrf2/ARE信号通路保护人表皮黑素细胞抵抗氧化应激损伤

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医学争鸣 2012年第5期3卷 20-20页

作者：坚哲李凯刘玲

过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激可能是白癜风中黑素细胞死亡的始动因素。核因子2相关转录因子2／抗氧化反应原件（NF—E2-related factor2／antioxidant response element，Nrf2／ARE）是抗氧化应激的主要信号通路，可调控抗氧化应激... 详细信息

过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激可能是白癜风中黑素细胞死亡的始动因素。核因子2相关转录因子2／抗氧化反应原件（NF—E2-related factor2／antioxidant response element，Nrf2／ARE）是抗氧化应激的主要信号通路，可调控抗氧化应激相关基因的表达。我们提出假说：在黑素细胞中，

关键词：表皮黑素细胞氧化应激损伤血红素氧合酶-1 信号通路 Nrf2 抗氧化应激保护相关转录因子