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乳酸杆菌对肠上皮黏附机制研究进展

世界华人消化杂志 2008年第23期16卷 2631-2636页

作者：沈通一秦环龙上海交通大学附属第六人民医院外科上海市200233

乳酸菌作为胃肠道的优势菌群,对于维护胃肠道微生态环境稳定有重要意义,而与宿主胃肠道上皮表面的黏附和定植是发挥这些作用的前提和基础.本文就乳酸杆菌黏附活性成分及其生物学特性,与肠上皮细胞的黏附机制及其影响因素的研究现状作一... 详细信息

乳酸菌作为胃肠道的优势菌群,对于维护胃肠道微生态环境稳定有重要意义,而与宿主胃肠道上皮表面的黏附和定植是发挥这些作用的前提和基础.本文就乳酸杆菌黏附活性成分及其生物学特性,与肠上皮细胞的黏附机制及其影响因素的研究现状作一综述.

关键词：乳酸杆菌黏附因子表层蛋白

具有潜在益生性的乳酸菌的筛选及其拮抗沙门氏菌黏附Caco-2细胞的机理研究

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具有潜在益生性的乳酸菌的筛选及其拮抗沙门氏菌黏附Caco-2细胞的...

作者：张汝京南京农业大学

学位级别：硕士

乳酸菌是常见的益生菌,在肠道属于优势菌群,对宿主的肠道健康有重要影响。乳酸菌要对人体发挥益生功能,前提是能够在肠道内定植和增生。因此,黏附和对胃肠道耐受力是体外筛选具有肠道益生特性乳酸菌的重要指标。沙门氏菌是常见的肠道致... 详细信息

乳酸菌是常见的益生菌,在肠道属于优势菌群,对宿主的肠道健康有重要影响。乳酸菌要对人体发挥益生功能,前提是能够在肠道内定植和增生。因此,黏附和对胃肠道耐受力是体外筛选具有肠道益生特性乳酸菌的重要指标。沙门氏菌是常见的肠道致病菌,对人畜都有致病能力。黏附也是沙门氏菌破坏肠道黏膜、产生毒素以及侵袭细胞的基础。研究乳酸菌抑制沙门氏菌黏附的机理,有助于明确乳酸菌对胃肠道环境的改善和对致病菌的防治,对肠道益生特性乳酸菌资源的开发和利用具有重要意义。本文研究以实验室保藏的15株乳酸菌为材料,它们都来源于发酵食品、对多种腐败菌有抗菌活性。通过对模拟胃肠道耐受力和对肠上皮Caco-2细胞黏附的筛选,得到一株益生特性优良的植物乳杆菌C174,并对其黏附性质与机理及拮抗沙门氏菌黏附机制进行研究。主要研究结果如下:1.具有肠道益生特性乳酸菌的初步筛选及菌种鉴定通过牛津杯法,筛选对鼠伤寒和肠炎沙门氏菌有抗菌活性的乳酸菌;通过模拟胃液和肠液的方法,筛选对胃肠道耐受力较强的乳酸菌;通过疏水性、自聚集和共聚集三个指标,对筛选乳酸菌进行评估。实验结果如下:15株乳酸菌对沙门氏菌的抗菌活性较强;有10株乳酸菌在模拟胃肠液环境中存活数到达106 CFU/mL以上;以耐受力较好的10株乳酸菌进行疏水性、自聚集和共聚集等性质评估,得到5株乳酸菌C37、C174、D24、D599及D512具有很好的益生潜力,5h内自聚集百分比在30%以上。通过生理生化和分子鉴定,发现这5株乳酸菌中有3株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、1 株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）和 1 株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。2.乳酸菌体外黏附Caco-2细胞能力的评估及其黏附性质的研究以公认黏附效果较好的标准菌株鼠李糖乳杆菌ATCC53103为对照菌株,通过Caco-2细胞模型对筛选的3株植物乳杆菌、1株发酵乳杆菌和1株短乳杆菌进行黏附评估实验。将筛选到黏附较高的植物乳杆菌C174进行菌体浓度、作用时间、菌体生长阶段、环境pH值及二价金属离子的黏附影响实验。实验结果如下:植物乳杆菌C174黏附效果最好,对Caco-2细胞黏附数达到7.4 bacteria/cell,略高于鼠李糖乳杆菌GG,其黏附数为5.4 bacteria/cell。以植物乳杆菌C174为研究对象,进行黏附性质及机理研究。发现植物乳杆菌C174对Caco-2细胞的黏附在共培养时间和菌体浓度上存在量效关系;同时发现处于稳定期的C174菌体的黏附效果要好于其它生长时期;在偏酸环境下有助于植物乳杆菌C174对Caco-2细胞的黏附;金属Ca2+离子对植物乳杆菌C174的黏附也有促进作用。通过不同化学处理菌株C174细胞表面,发现表层蛋白介导了菌株C174对Caco-2细胞的黏附。用5 M氯化锂提取菌株C174表层蛋白,SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳分析其分子量大小为41 kDa。3.植物乳杆菌C174抑制沙门氏菌的黏附及其表层蛋白的功能特性研究通过研究菌体浓度和作用方式对植物乳杆菌C174抑制沙门氏菌黏附Caco-2细胞的影响;通过检测细胞膜的通透性分析益生菌对Caco-2细胞的保护作用。结果发现植物乳杆菌C174对沙门氏菌黏附的抑制作用存在量效关系;在作用方式上,C174主要通过排除作用抑制沙门氏菌的黏附,其次是竞争作用,替代不明显,表明提前加入益生菌C174可排斥沙门氏菌的黏附和侵袭。细胞膜通透性结果表明C174和沙门氏菌共同作用细胞时,可通过竞争性占位效应,保护宿主免受损伤。通过去除表层蛋白,在排除和竞争方式上,植物乳杆菌C174抑制沙门氏菌黏附的作用减弱,对胃肠道耐受性也降低,同时菌株的自聚集能力也显著下降,结果说明表层蛋白介导菌株C174的黏附是其抑制沙门氏菌黏附的基础;表层蛋白起着保护乳杆菌C174抵抗不利环境的作用;表层蛋白的高等电点和高疏水性氨基酸还影响着菌株C174的聚集。

关键词：乳酸菌黏附黏附抑制 Caco-2细胞表层蛋白

高黏附乳酸菌的筛选及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用

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高黏附乳酸菌的筛选及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用

作者：占萌东北农业大学

学位级别：硕士

乳酸菌是一类有益于宿主健康的微生物,主要通过在肠道中的定植发挥益生作用。乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附、定植作用有助于恢复或增强肠道稳态,提高机体免疫力。因而乳酸菌的黏附能力是评价其益生性的重要指标。然而,有些具有益生功能... 详细信息

乳酸菌是一类有益于宿主健康的微生物,主要通过在肠道中的定植发挥益生作用。乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附、定植作用有助于恢复或增强肠道稳态,提高机体免疫力。因而乳酸菌的黏附能力是评价其益生性的重要指标。然而,有些具有益生功能的乳酸菌作用效果和稳定性却不尽如人意。所以筛选出一株黏附能力高,又具有免疫调节潜力的乳酸菌,对开发高效的免疫调节益生菌制剂尤为重要。本课题旨在从实验室保藏的12株乳杆菌和2株耐久肠球菌中筛选出高黏附性乳酸菌,并分析影响该菌株黏附性的因素,对黏附机制进行初步探究。最后评价了该株高黏附乳酸菌对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。选取具有良好黏附性能的嗜酸乳杆菌NCFM作为对照,通过对14株不同种乳酸菌进行表面疏水性、自聚集能力以及体外黏附Caco-2细胞能力的测定,筛选出高黏附性乳酸菌菌株。并分析了表面性质与黏附性之间的关系。结果发现嗜酸乳杆菌KLDS 1.0901对Caco-2细胞的黏附率是受试的15株菌中最高的,为12.73%,且KLDS 1.0901具有仅次于耐久肠球菌KLDS6.0933的疏水率,为13.88%。鼠李糖乳杆菌KLDS1.0205的黏附能力最低,为0.13%。不同乳酸菌的表面疏水性与对Caco-2细胞的黏附能力呈现一定的相关性。采用体外实验探究了高黏附性嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的浓度、生长阶段、化学和酶处理对其黏附Caco-2细胞能力的影响。试验结果表明,KLDS1.0901的生长阶段显著影响其黏附性。菌体浓度为100 CFU/mL时,对黏附性影响不显著。KLDS1.0901对Caco-2细胞的黏附可能是以表层蛋白为主的多种黏附素共同作用的结果。结合透射电镜和SDS-PAGE技术,初步分离、鉴定了KLDS1.0901的表层蛋白。结果表明KLDS1.0901表面具有丰富的绒毛状表层蛋白,含量约为15.6%,分子量大约为43 kDa。并证实表层蛋白粗提物能显著抑制KLDS1.0901对Caco-2的黏附,且浓度越大,抑制作用越强。采用流式细胞术分析了未处理、去除表层蛋白和热致死的KLDS1.0901在小鼠肠道中的定植与分布。结果表明,KLDS1.0901在灌胃前期主要黏附于十二指肠和空肠,后期KLDS1.0901趋向于黏附结肠。而去除表层蛋白和热灭活的KLDS1.0901虽然在第一天能大量黏附于十二指肠,但是只能短暂停留于肠道各部位,随着时间推移,这两组在肠道各部位的黏附量显著减少。从体内证实了KLDS1.0901也能在小鼠肠道内长时间黏附定植,并且其表面的表层蛋白同样能显著影响其在体内的黏附能力。体外探究了高黏附菌株KLDS1.0901对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。测定了不同剂量的未处理KLDS1.0901(LLA)、去除表层蛋白KLDS1.0901(RSLA)和热致死的KLDS1.0901(HKLA)对巨噬细胞增殖能力及吞噬作用的影响;以及刺激巨噬细胞后IL-10和TNF-α分泌水平及其对应mRNA的表达量。试验结果表明:当菌体与巨噬细胞以10:1和1:1共同孵育时,LLA和HKLA组均能显著促进巨噬细胞的增殖,但只有LLA能显著促进巨噬细胞的吞噬活性。在所有浓度下,RSLA组均显著抑制了巨噬细胞活性。并证实KLDS1.0901表面的表层蛋白是增强巨噬细胞活性的重要物质,当以500μg/mL的表层蛋白粗品刺激巨噬细胞时,其增殖和吞噬活性最强。KLDS1.0901与巨噬细胞以1000:1共同孵育时,与空白对照组相比,LLA显著抑制了IL-10和TNF-的分泌。其他浓度条件下:LLA,RSLA和HKLR组IL-10的分泌水平均显著高于对照组,但远低于LPS组;LLA、RSLA和HKLA能够诱导细胞分泌与LPS组相同水平的TNF-α。与空白对照组相比,当菌体与巨噬细胞以100:1共培养时,LLA和HKLA均能显著上调IL-10和TNF-mRNA表达水平。这与细胞因子水平的测定结果相佐证。结论为筛选得到一株表层蛋白含量丰富、黏附性高和具有免疫调节潜力的嗜酸乳杆菌KLDS1.0901。该菌株有作为粘膜疫苗载体使用的潜能,亦可开发成高效调节机体免疫的益生菌。

关键词：嗜酸乳杆菌黏附表层蛋白免疫调节

戊糖乳杆菌降N-亚硝胺及其在香肠发酵中的应用研究

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戊糖乳杆菌降N-亚硝胺及其在香肠发酵中的应用研究

作者：肖亚庆合肥工业大学

学位级别：硕士

近年来,肉制品安全性引发了全世界的广泛关注。N-亚硝胺(NAs)是肉制品中的常见致癌物。微生物发酵法降NAs成为新的研究领域。本研究以肉源性有益菌为研究对象,通过模拟体系试验筛选获得降NAs能力较强的菌株,探讨该菌株降NAs的机理,并将... 详细信息

近年来,肉制品安全性引发了全世界的广泛关注。N-亚硝胺(NAs)是肉制品中的常见致癌物。微生物发酵法降NAs成为新的研究领域。本研究以肉源性有益菌为研究对象,通过模拟体系试验筛选获得降NAs能力较强的菌株,探讨该菌株降NAs的机理,并将其应用到香肠中,考察接种发酵对香肠NAs含量、菌群结构、品质和理化特性的影响规律。研究结果表明:(1)在模拟体系(MRS培养基)中,戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)R3是降NAs能力较强的受试菌株;当*** R3接种浓度为107 CFU/m L,37°C振荡(145 rpm)条件下培养20 h时,体系中N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)2种NAs的含量分别降低了22%和23%以上。(2)*** R3通过降解途径降低了体系中的NDMA和NDEA含量;位于*** R3细胞碎片上的表层蛋白是降解NAs的有效成分;质谱鉴定结果显示,*** R3表层蛋白是一种假定蛋白。(3)接种*** R3能促进香肠发色,促进肌原纤维蛋白降解,且不会对香肠的质构特性和感官品质产生不利影响;接种*** R3能有效加快香肠的脱水进程,从而提高其贮藏性。(4)接种*** R3能显著降低香肠中NAs含量(P<0.05);成熟后期,接种组香肠的亚硝酸盐残留量、羰基含量、挥发性盐基氮(TVB-N)含量、硫代巴比妥酸值(TBARS)、p H和水分活度(aw)值显著低于对照组(P<0.05)。(5)接种*** R3能增强香肠优势菌的竞争性并抑制不良微生物的生长;分离自接种发酵香肠的菌群具有降解NAs的能力。

关键词：戊糖乳杆菌 N-亚硝胺香肠表层蛋白菌群结构

植物乳杆菌修复LPS诱导肠上皮细胞紧密连接损伤的机制研究

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植物乳杆菌修复LPS诱导肠上皮细胞紧密连接损伤的机制研究

作者：张欣东北农业大学

学位级别：硕士

肠道上皮细胞损伤引起的肠道疾病,已经演变成一种全球化的疾病,严重危害着人体健康。国内外大量的动物试验和临床试验证明了乳酸菌保护肠黏膜屏障的益生作用,但有关其增进肠上皮紧密连接的作用机制仍不清楚。因此,本文以前期获得的能有... 详细信息

肠道上皮细胞损伤引起的肠道疾病,已经演变成一种全球化的疾病,严重危害着人体健康。国内外大量的动物试验和临床试验证明了乳酸菌保护肠黏膜屏障的益生作用,但有关其增进肠上皮紧密连接的作用机制仍不清楚。因此,本文以前期获得的能有效减轻肠炎的植物乳杆菌1.0318为研究对象,构建脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的肠上皮细胞（Caco-2）紧密连接损伤模型,首先采用RT-PCR、蛋白印迹和透射电镜等技术,分析植物乳杆菌1.0318表面成分及代谢物（如表层蛋白,肽聚糖及胞外多糖）调节紧密连接结构及相关蛋白表达的作用;进而结合基因超表达技术,探查关键mi RNAs参与菌体成分修复受损肠上皮紧密连接的作用;同时,采用蛋白印迹和免疫荧光等技术分析菌体成分调节MLCK-MLC信号通路与修复紧密连接损伤的关联。以期从mi RNAs和信号通路层次揭示益生保护肠道黏膜屏障的分子机制,对开发高效的益生菌制剂具有重要的现实意义。一、植物乳杆菌1.0318主效成分修复紧密连接损伤的作用分别利用植物乳杆菌1.0318黏附素（表层蛋白,肽聚糖）及代谢产物（胞外多糖）干预LPS诱导的Caco-2细胞紧密连接损伤模型。结果显示,植物乳杆菌1.0318菌成分处理后能有效改善LPS诱导所致的Caco-2细胞电阻值显著下降,通透性显著升高,紧密连接出现连接断裂,细胞缝隙增大及肠道微绒毛大量脱落等情况。与肽聚糖和胞外多糖组相比,表层蛋白组紧密连接超微结构损伤和微绒毛脱落状况较轻,且电阻值和紧密连接蛋白ZO-1,Occludin表达水平更高。故后续以植物乳杆菌表层蛋白为实验对象,进一步探究修复紧密连接损伤的机制。二、mi RNAs参与植物乳杆菌1.0318表层蛋白修复紧密连接损伤的作用首先观察植物乳杆菌表层蛋白对紧密蛋白损伤相关mi RNAs表达的影响,确定关键mi RNA。实验发现表层蛋白干预降低了LPS诱发的mi RNs过表达,特别是显著抑制了mi R-200c表达。进一步研究发现,转染mi R-200c模拟物抑制了表层蛋白上调细胞电阻、促进紧密连接ZO-1、Occludin和Claudin-1表达的能力,且模拟物转染消除了表层蛋白对LPS诱导的Caco-2细胞通透性的降低作用。以上结果提示植物乳杆菌表层蛋白通过抑制肠上皮mi R-200c表达修复紧密蛋白损伤。三、植物乳杆菌1.0318表层蛋白介导MLCK-MLC通路修复紧密连接损伤的作用建立LPS诱导的Caco-2细胞紧密连接损伤模型,分别利用表层蛋白、NF-κB抑制剂和MLCK抑制剂组进行干预,分析表层蛋白对紧密连接损伤细胞中MLCK-MLC通路的影响。结果显示,LPS紧密连接损伤组的NF-κB p65和MLCK-MLC相关蛋白显著升高,而紧密连接蛋白表达量显著下降,且细胞间荧光分布不均匀,强度减弱,细胞间隙增大。经表层蛋白、NF-κB抑制剂和MLCK抑制剂处理后,MLCK-MLC相关通路蛋白MLCK、MLC、p-MLC表达水平显著下降,紧密连接蛋白表达量和荧光强度显著提高,紧密连接沿着细胞膜分布,且三组间无显著差异。以上结果表明,植物乳杆菌1.0318菌成分表层蛋白,肽聚糖和胞外多糖均能有效修复LPS诱导Caco-2细胞紧密连接损伤,并且表层蛋白的修复效果显著优于肽聚糖和胞外多糖。进一步的研究发现,表层蛋白可能是通过降低mi R-200c表达,抑制MLCK-MLC信号通路发挥紧密连接损伤修复作用,为益生菌预防肠道屏障功能障碍提供新的理论依据。

关键词：植物乳杆菌1.0318 表层蛋白紧密连接 miRNAs MLCK-MLC信号通路

苏云金芽孢杆菌毒素杀灭谱:从昆虫到人类癌细胞

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绿色科技 2021年第6期23卷 205-207页

作者：张琳琳杜忠华夏津一中山东德州254300

指出了苏云金杆菌(Bt)是一种广泛存在于土壤、昆虫尸体、叶面、水和储粮中的细菌,能产生多种毒性蛋白质,每一种分别对不同的生物目标如昆虫、线虫、螨虫、原生动物和哺乳动物细胞具有毒性。研究了大多数Bt毒素通过结合特定的细胞膜受体... 详细信息

指出了苏云金杆菌(Bt)是一种广泛存在于土壤、昆虫尸体、叶面、水和储粮中的细菌,能产生多种毒性蛋白质,每一种分别对不同的生物目标如昆虫、线虫、螨虫、原生动物和哺乳动物细胞具有毒性。研究了大多数Bt毒素通过结合特定的细胞膜受体来识别其特定的靶点。结果表明:Cry毒素还可以通过与特定受体的相互作用杀死人类癌细胞。副孢毒素(Parasporins)是一小类毒素,可能具有杀虫活性,可以通过识别特定的膜受体杀死多种哺乳动物癌细胞。表层蛋白(SLP)与Bt产生的其它蛋白质不同,也在大多数细菌和古细菌种产生。SLP能与昆虫和人类癌细胞的膜受体相互作用。Cyt毒素的结构与Cry毒素不同,具有不同的作用机制,它主要对可传播人类疾病的蚊子幼虫具有毒性,如按蚊、伊蚊和库蚊。除了孢子形成过程中产生的Cry、Cyt、SLP和副孢毒素外,Bt菌株在营养生长期也产生具有杀虫活性的Vip(营养期杀虫毒素)和Sip(分泌性杀虫蛋白)毒素。

关键词：苏云金杆菌副孢毒素表层蛋白抗癌活性