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四氮唑探针在表型筛选、活性导向的蛋白谱分析及肿瘤生物标志物检测中的应用

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四氮唑探针在表型筛选、活性导向的蛋白谱分析及肿瘤生物标志物检...

作者：程柯暨南大学

学位级别：硕士

表型筛选是药物研发中重要的手段,通过表型筛选可以获得大量生物学活性较好的化合物,然而这些化合物在体内的作用模式和作用靶点往往难以确证。为解决这样的困难,本课题将表型筛选结合了近年来发展的活性导向的蛋白谱分析(ABPP)方法,即... 详细信息

表型筛选是药物研发中重要的手段,通过表型筛选可以获得大量生物学活性较好的化合物,然而这些化合物在体内的作用模式和作用靶点往往难以确证。为解决这样的困难,本课题将表型筛选结合了近年来发展的活性导向的蛋白谱分析(ABPP)方法,即通过表型筛选获得具有良好活性的化合物,并进一步利用ABPP方法确证其体内作用靶点。活性导向的蛋白谱分析(ABPP)在药物研究领域被广泛地应用于寻找与疾病相关联的新靶标、鉴定药物分子的作用靶点。其技术特点是通过引入分子探针,使药物或活性化合物与靶标蛋白质共价结合,随后进行后续分离及鉴定工作。由于多数活性分子与蛋白质之间是非共价结合,因此需要引入光亲和基团使分子探针与蛋白质在紫外光照射下形成共价键。目前常见的光亲和标记基团均存在一定的缺陷,如二苯甲酮需要较长紫外光照时间,芳基叠氮与靶标蛋白共价结合效率低于30%等。近期有研究表明2,5-二芳基四氮唑基团能在较短时间的紫外光照下、高效率地与目标蛋白共价结合。因此2,5-二芳基四氮唑基团有可能克服上述基团的缺陷,发展为新型的光亲和基团。本课题研究了不同取代基的2,5-双取代四氮唑基团作为光亲和基团,初步发现了2,5-二苯基取代的四氮唑具有最好的光亲和标记效率,并以此为基础合成了一系列四氮唑探针分子。通过对这一系列探针分子进行筛选,我们发现了一些四氮唑探针分子具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。随后借助ABPP方法,我们发现并初步验证了ANXA2,FLAD1和NOS2等潜在的体内靶点。此外,本研究发现其中一个四氮唑探针分子,能在活体肿瘤细胞中专一性标记和显影膜联蛋白Ⅱ(一种肿瘤标志物)。以上这些具有活性的四氮唑分子对于肿瘤相关疾病的诊断和治疗具有潜在的价值。

关键词：表型筛选活性导向的蛋白谱分析方法光亲和基团四氮唑探针药物靶点细胞成像蛋白质组学肿瘤标志物

基于肿瘤细胞表型筛选模型的靶向抗癌先导化合物的发现与药物作用机制研究

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基于肿瘤细胞表型筛选模型的靶向抗癌先导化合物的发现与药物作用...

作者：曾然然华南理工大学

学位级别：硕士

药物创新主要经过先导化合物的发现,先导化合物的优化以及临床研究阶段。先导化合物的发现是药物创新的源头,能否发现新颖且成药性好的先导化合物,直接关系到一个药物创新项目的成败。先导化合物的发现有两种模式:基于靶标的药物筛选和... 详细信息

药物创新主要经过先导化合物的发现,先导化合物的优化以及临床研究阶段。先导化合物的发现是药物创新的源头,能否发现新颖且成药性好的先导化合物,直接关系到一个药物创新项目的成败。先导化合物的发现有两种模式:基于靶标的药物筛选和基于表型的药物筛选。近年来,表型药物筛选因与疾病有紧密的关联以及更有利于一类新药的发现而受到广泛关注,并被赋予了新的内涵,即现代表型药物筛选。据一项源于Nature Reviews Drug Discovery的报道,一类新药(First-in-class drugs)的发现主要采用基于表型的药物筛选模式,并且呈递增趋势;而二类新药(Follower drugs)的发现,主要依赖于基于靶标的药物筛选模式,同样呈递增趋势。现代表型药物筛选包括基于动物、器官、组织、细胞模型的药物筛选,其研究手段不仅限于纯实验手段,还可以借助计算药物分子设计等方法。细胞水平的活性是连接靶标水平与动物水平活性的桥梁。本研究基于NCI-60癌细胞表型筛选大数据,借助机器学习方法,建立化合物的抗癌细胞活性预测模型,采用五倍交叉验证、外部验证、Y-Scrambling等方法对所建模型进行验证。同时,应用这个NCI-60抗癌细胞活性预测模型,对ChemDiv化合物数据库进行虚拟筛选。虚拟筛选得到了14个抗肿瘤先导化合物,其中活性最好的先导化合物G03在MDA-MB-231、Hela、HCT-116、HepG2、MCF-7五种细胞系上的IC50分别为2.82μM、2.90μM、2.98μM、3.20μM以及4.61μM。靶标研究对基于表型筛选得到的药物至关重要。针对活性最好的抗癌先导化合物G03,运用基于分子相似度的虚拟靶标钓取方法和SPR实验,确定G03的靶标为微管蛋白。从微管动力学、细胞内微管的稳定性、微管蛋白的乙酰化水平等多角度研究G03与微管之间的相互作用。微管对细胞周期、细胞迁移等生理过程都有重要影响,因此,很有必要研究G03对细胞周期、凋亡、迁移及侵袭的作用。第一章介绍当前主要的药物发现的策略、研究进展以及NCI-60数据库的研究进展。第二章介绍基于NCI-60抗癌细胞表型筛选的活性预测模型的构建与模型验证。第三章介绍基于NCI-60抗癌细胞活性预测模型的先导化合物发现。第四章介绍先导化合物G03的靶标研究与药物作用机制研究。第五章为展望和总结。概述本课题研究的创新之处与课题的进一步深入研究方向。

关键词：表型筛选虚拟筛选 NCI-60 微管蛋白

水稻细菌性条斑病菌Tn5突变体的表型筛选与突变位点定位

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水稻细菌性条斑病菌Tn5突变体的表型筛选与突变位点定位

作者：卢香浓广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola,Xoc)引起的水稻细条病对广西部分地区水稻产量造成影响。随着水稻与Xoc菲律宾代表菌株BLS256相继测序成功,Xoc—水稻的互作已成为研究病原菌—植物互作的模式之一。广西菌株G... 详细信息

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pathovar oryzicola,Xoc)引起的水稻细条病对广西部分地区水稻产量造成影响。随着水稻与Xoc菲律宾代表菌株BLS256相继测序成功,Xoc—水稻的互作已成为研究病原菌—植物互作的模式之一。广西菌株GX01的测序也基本完成,如此丰富的静态碱基序列信息正等待着我们从中挖掘动态的病原菌生物学功能。突变体库是功能基因组学研究的基础,转座子可移动及可体外驱动转座的特点被广泛应用于介导插入突变体库的构建,逐渐成为一个研究黄单胞菌的强大工具。本研究以广西菌株Xoc GX01作为建库出发菌株,利用EZ-Tn5TM 转座子介导的方法构建了Tn5插入突变体库。第一次电转化共保存2965个单克隆的转化子,并对这一批转化子的胞外多糖、胞外蛋白酶、游动性、生物膜等表型进行检测。目前已完成的2200个突变体表型筛选中,我们筛选到胞外多糖分泌能力增强的突变体26个,胞外多糖分泌能力减弱的突变体31个,胞外蛋白酶活性增强的突变体77个,胞外蛋白酶活性减弱的突变体16个,游动性增强的突变体61个,游动性减弱的突变体507个,并发现出现生物膜现象的突变体67个。为了验证确实有转座子的插入,我们从突变体库中随机选取了17个突变体,提取它们的总DNA,用鉴定引物PCR验证,均能扩增出568bp的目的产物,证明这些转化子均有Tn5插入,假阳性率低。并利用质粒拯救的方法进一步获取其转座子的侧翼序列,与XocGX01全基因组进行本地序列比对(BLAST),相似性百分比在97%以上,侧翼序列的真实性比较高,是一种相对高效的定位方法。同时,我们从筛库过程中选取表型变化相对明显的突变体BH90和BA87进行致病力检测,它们的致病力均有不同程度的下降,其定位信息分别为XOC2200和XOC2216。为进一步研究这两个基因的功能,同时构建了XOC2200和XOC2216的缺失突变体及其互补菌株。XOC2200的编码产物为Transcriptional regulator,flagellar regulatory protein A;XOC2216的编码产物为flagellar biosynthesis hook protein。其中Tn5插入突变体BH90及XOC2200的缺失突变体胞外多糖及游动性显著提高,互补菌株表型基本能够恢复到野生型状态,推测XOC2200可能反向调控胞外多糖的合成及Xoc的游动性。Tn5插入突变体BA87及XOC2216的缺失突变体胞外蛋白酶活性有所增加,游动性下降,推测XOC2216可能影响Xoc的胞外蛋白酶活性及游动性。

关键词：水稻细菌性条斑病菌 EZ-Tn5TM转座子突变体库表型筛选质粒拯救

基于细胞的药物表型筛选及表型组学的计算研究

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基于细胞的药物表型筛选及表型组学的计算研究

中国化学会第29届学术年会

作者：徐筱杰陈丽蓉古江勇罗芳北京大学化学与分子工程学院

近年来基于动物、器官、组织、细胞的表型筛选因与疾病有紧密的关联及更利于一类新药的发现而受到广泛关注。基于细胞的表型筛选在保持合理的实验效率的同时,还体现了疾病相关生物途径及其相互作用的系统特征。因此细胞的表型筛选,特别... 详细信息

近年来基于动物、器官、组织、细胞的表型筛选因与疾病有紧密的关联及更利于一类新药的发现而受到广泛关注。基于细胞的表型筛选在保持合理的实验效率的同时,还体现了疾病相关生物途径及其相互作用的系统特征。因此细胞的表型筛选,特别是最近发展的针对细胞特定功能的生物途径的筛选策略将成为有前景及重要的药物筛选途径。人类表型组学是研究人类的所有表型性状,表型间的关联及表型与不同疾病之间的关系。表型组学的目的是利用新型高通量计算和信息学技术推导基因型-表型关联及全基因组分子网络。目前一个清晰的趋势是人类疾病机制的研究已开始从遗传学向表型组学转移。近年来我们课题组发展了针对细胞多种特定功能的生物途径的药效及药物分子间的协同或拮抗作用的计算评估方法。目前我们也在发展关联不同细胞表型及表型与疾病关系的计算方法。

关键词：药物筛选表型筛选表型组学协同拮抗

来源： cnki会议评论

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活性天然产物靶标蛋白的鉴定

化学学报 2018年第3期76卷 177-189页

作者：周怡青肖友利中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所/分子植物科学卓越创新中心中国科学院合成生物学重点实验室上海200032 中国科学院大学北京100039

天然产物是创新药物的重要来源,确定活性天然产物的靶标蛋白和作用机制是新药开发的关键.在本篇综述中,对近二十年来在活性天然产物靶标鉴定领域出现的新技术和新方法进行简要的回顾和总结,通过实例重点介绍化学蛋白质组学和生物物理学... 详细信息

天然产物是创新药物的重要来源,确定活性天然产物的靶标蛋白和作用机制是新药开发的关键.在本篇综述中,对近二十年来在活性天然产物靶标鉴定领域出现的新技术和新方法进行简要的回顾和总结,通过实例重点介绍化学蛋白质组学和生物物理学方法在天然产物靶标蛋白鉴定方面的应用,讨论各种策略的优势和不足,并对其适用范围,应用前景和发展趋势作了前瞻性的展望.

关键词：天然产物靶标鉴定化学蛋白质组学生物物理学表型筛选

基于功能宏基因组学技术的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制物的发现与活性分析

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生物工程学报 2017年第9期33卷 1525-1532页

作者：朱莹柴树茂曹明明王绍琛冯治洋南京农业大学食品科技学院江苏南京210095

宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环... 详细信息

宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环境DNA接合转移到链霉菌宿主中。通过活性筛选获得两个具有抗菌活性的阳性链霉菌克隆,其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均有很好的抑制作用,当浓度达到2 MIC(Minimum inhibitory concentration)时,抑制作用超过90%;同时,两种粗提物样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用,其中EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率高于EM123样品。本文通过功能宏基因组学技术,直接从土壤中筛选获得了对金黄色葡萄球菌生物被膜有较强抑制及清除作用的活性物质。

关键词：宏基因组学接合转移表型筛选金黄色葡萄球菌生物被膜抑制剂

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新一代人工智能技术驱动下的新药研发

中国药理学通报 2019年第7期35卷 889-893页

作者：吴昊林铭孙懿赵欣蒲小平北京大学药学院分子与细胞药理学系

传统新药研发风险高而且周期长,资金投入也逐年增长,而人工智能(artificial intelligence,AI)技术可以改变传统新药研发模式,提高研发效率并降低再研成本。AI技术不仅能应用于靶点筛选,还能应用于表型筛选(phenotypic screening),从而... 详细信息

传统新药研发风险高而且周期长,资金投入也逐年增长,而人工智能(artificial intelligence,AI)技术可以改变传统新药研发模式,提高研发效率并降低再研成本。AI技术不仅能应用于靶点筛选,还能应用于表型筛选(phenotypic screening),从而开展针对复杂疾病的新药研发,同时,小样本学习使得AI技术更加具有普适性。而AlphaGo Zero的出现为AI技术带来重大突破,将会推动新药研发的快速发展。

关键词：新药研发人工智能技术靶点筛选表型筛选小样本学习 AlphaGo Zero

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抗肿瘤多肽的高效筛选方法及研究现状

药学学报 2020年第10期55卷 2298-2305页

作者：沈莉莉王姣姣陈吴越周婧马宏跃许惠琴程海波陆茵段金廒南京中医药大学药学院江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心江苏南京210023 江苏省中药药效与安全性重点实验室江苏南京210023 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心江苏南京210023

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病,常规抗肿瘤的化疗药物存在易耐药和不良反应的问题。而天然毒液肽和人工设计的靶向多肽分子质量小,易到达或亲和于肿瘤组织,具有较好的抗癌活性和成药性,其发现、筛选和鉴定方法引起大家广泛关注。本... 详细信息

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病,常规抗肿瘤的化疗药物存在易耐药和不良反应的问题。而天然毒液肽和人工设计的靶向多肽分子质量小,易到达或亲和于肿瘤组织,具有较好的抗癌活性和成药性,其发现、筛选和鉴定方法引起大家广泛关注。本文首先列举了近年来热点研发的抗肿瘤多肽类型,进而介绍了基于传统色谱分离、肽组学、噬菌体展示、生物表型以及人工智能技术的活性肽、靶向肽筛选原理、方法和实例应用,以期为未来新型抗肿瘤多肽的研发提供方法学借鉴和参考。

关键词：抗肿瘤多肽色谱分离肽组学噬菌体展示技术表型筛选

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调控生物钟的小分子化合物的研究进展

中国药房 2021年第7期32卷 890-896页

作者：凡杰夫何颖王伟忠谭兴张建王杨凯海军特色医学中心海洋生物医药与极地医学研究室上海200433

目的:了解调控生物钟的小分子化合物的研究进展,为生物节律干预策略的研究和相关药物的研发提供参考。方法:对钟基因的调控机制、调控生物钟的小分子化合物[如靶向蛋白激酶、靶向核受体、靶向隐花色素蛋白(CRY)、靶向时钟蛋白(CLOCK)]... 详细信息

目的:了解调控生物钟的小分子化合物的研究进展,为生物节律干预策略的研究和相关药物的研发提供参考。方法:对钟基因的调控机制、调控生物钟的小分子化合物[如靶向蛋白激酶、靶向核受体、靶向隐花色素蛋白(CRY)、靶向时钟蛋白(CLOCK)]的作用机制及其筛选和鉴定方法进行综述。结果与结论:生物体内与生物钟的发生和维持相关的基因被称为节律基因,包含钟基因和钟控基因两类。钟基因是维持生物钟节律的关键,其表达受到转录-翻译反馈环路的调控。钟基因表达失调将导致生物钟节律的减弱或紊乱,从而导致多种疾病的发生、发展。生物钟相关蛋白调控小分子化合物可靶向蛋白激酶参与的翻译后修饰,在生物钟的调控中具有重要作用,其突变可能参与了多种由生物钟紊乱所致的疾病;靶向核受体的小分子化合物可对癌细胞产生明显的细胞毒性效果,可为多效抗癌药的研发提供帮助;靶向CRY的小分子化合物可增强CRY稳定性和CRY-周期基因(PER)蛋白复合体对核转运类似蛋白1(BMAL1)-CLOCK的抑制作用,减少关键钟基因的表达,从而使患者胶质母细胞瘤干细胞发生周期停滞,引起凋亡增加;靶向CLOCK的小分子化合物是调控钟基因转录-翻译反馈环路的重要组成部分,其含量和活性能显著影响生物钟的稳定性和振幅强度。目前,对大多数小分子调节物质的研究仍停留在基础实验阶段,还存在对钟蛋白的精确调控存在困难,对BMAL1和PERs等关键钟蛋白的调节物的研究仍处于盲区等不足;而对已知调控生物钟的小分子化合物,进一步的修饰与改造、优化其药动学特性、减轻其不良反应,是该领域重要的研究方向。

关键词：生物节律钟基因小分子化合物表型筛选靶向筛选生物钟调控