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畜牧与兽医 2020年第5期52卷 64-72页

作者：熊甘爽 Alkasir Rashad 仲亮律娜戴建君李晶汤芳朱宝利南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国科学院微生物研究所北京100101

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致奶牛乳房炎的主要病原菌,其在抗菌药物的作用下可形成小菌落突变株(small colony variants,SCVs)。为了探讨牛源性金黄色葡萄球菌在表型转变过程中的遗传基础,对临床分离的奶牛乳房炎金黄... 详细信息

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致奶牛乳房炎的主要病原菌,其在抗菌药物的作用下可形成小菌落突变株(small colony variants,SCVs)。为了探讨牛源性金黄色葡萄球菌在表型转变过程中的遗传基础,对临床分离的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌野生型及其SCV、人工诱导的SCV、临床SCV的表型回复株进行了相关特性及基因组序列的分析。结果发现:金黄色葡萄球菌的SCV和野生型差异显著,野生型菌株在庆大霉素及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(SXT)的诱导下绝大多数产生甲萘醌缺陷型SCV,仅有1株经SXT诱导产生的SCV为胸腺嘧啶核苷(胸苷)缺陷型。菌株基因与表型之间存在明显关联,与野生型基因组相比,临床SCV均显示喹啉/醌代谢相关基因menA的碱基缺失,可能导致蛋白表达提前终止。庆大霉素诱导的SCV在基因menB处出现碱基位点突变;SXT诱导的SCV在代谢相关基因MW1485和aroA处分别出现基因片段的缺失和插入。回复株可能通过在代谢相关基因menA二次突变来恢复功能。本研究首次利用全基因组测序技术分析牛源性金黄色葡萄球菌SCV表型改变的遗传基础,有助于对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌SCV产生更深入的理解。

关键词：金黄色葡萄球菌小菌落突变株表型回复甲萘醌缺陷突变奶牛乳房炎

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奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌小菌落突变株的表型鉴定及其遗传基础分析

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌小菌落突变株的表型鉴定及其遗传基础分...

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作者：熊甘爽南京农业大学

学位级别：硕士

奶牛乳房炎（Mastitis）是一种常见的奶牛疾病,在国内外广泛流行,造成巨大的经济损失,同时引发食品安全问题和威胁人类健康。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌,且具有潜在人畜共患风险。控制金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎感染... 详细信息

奶牛乳房炎（Mastitis）是一种常见的奶牛疾病,在国内外广泛流行,造成巨大的经济损失,同时引发食品安全问题和威胁人类健康。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌,且具有潜在人畜共患风险。控制金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎感染的主要策略是抗生素治疗,然而,金黄色葡萄球菌长期处于抗生素等选择压力时,经常表现出对多种抗菌药物的耐药性。形成小菌落突变株（small colony variants,SCVs）作为金黄色葡萄球菌抵抗抗生素等药物杀灭的重要策略,对慢性持续性奶牛乳房炎的产生有重要意义。SCV是一种具有独特表型和致病特征的细菌亚群,常与持续性或复发性感染有关,其主要特征包括:生长缓慢,代谢障碍,菌落无色素,溶血性降低,毒素生成减少,凝固酶活性延迟,对氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素敏感性降低等。为了更好地防治牛源性金黄色葡萄球菌SCV,本研究在带有乳房炎病史的奶牛乳汁中分离并鉴定金黄色葡萄球菌,获得了奶牛乳房内感染金黄色葡萄球菌SCV的情况,得到临床野生型菌株和相应的SCV菌株。通过对临床分离的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌野生株和SCV菌株分别进行诱导和回复,分析了分离株、诱导株及回复株的特性,发现所有的野生型菌株显示出典型的快速生长表型,而SCV菌株表现出生长缓慢,代谢障碍等SCV的典型表型特征。同时,SCV菌株显示出营养缺陷及耐药性升高的特性。全基因组测序结果揭示了与SCV表型相关的关键基因,并描述了SCV在表型回复的过程中基因的适应现象。1.临床野生型金黄色葡萄球菌及SCV的分离从中国北方某奶牛场选取5头曾患有金黄色葡萄球菌乳房炎的奶牛,进行细菌分离培养,得到临床野生型金黄色葡萄球菌8株,在其中一份样品中同时分离到1株表型稳定的SCV菌株（即106 SCV菌株）。通过对106 SCV分离株和相应野生型金黄色葡萄球菌分离株（即107菌株）进行表型鉴定及基因型鉴定,经多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple loci VNTR analysis,MLVA）,结果表明,二者属于同一分子类型。通过营养缺陷试验,发现106 SCV为甲萘醌营养缺陷型。首次在国内发现牛源性甲萘醌营养缺陷型的金黄色葡萄球菌SCV菌株。2.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌SCV的诱导、回复及特性研究金黄色葡萄球菌的SCV与奶牛慢性持续性乳房炎有密切联系,SCV表型和野生菌株表型特性存在显著差异。本研究对野生型分离株101、107分别进行人工诱导,对相应SCV菌株102、106分别进行回复,并分析了分离株、诱导株及回复株的相关特性。诱导试验显示野生型菌株在庆大霉素及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（SXT）的诱导下绝大多数产生甲萘醌缺陷型SCV,仅有1株经SXT诱导产生的SCV属于胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（简称胸苷）营养缺陷型。经SXT诱导出现甲萘醌缺陷表型的SCV目前未见报道。回复试验显示102和106均可发生表型回复,且回复株不再出现营养缺陷。所有的野生型菌株生长快速,而SCV菌株具有生长缓慢,代谢障碍等SCV的典型表型。药敏试验表明SCV菌株对大部分所试抗菌药物耐药性增强,尤其是对硫酸庆大霉素和青霉素G钠的耐药性显著高于相应的野生型菌株。诱导株耐药性显著升高,且耐药特性与其缺陷类型符合。回复株对多种抗菌药物的敏感性回升。3.形成奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌SCV特性的遗传基础研究表明,金黄色葡萄球菌SCV的特性改变及发生表型回复时的适应现象与金黄色葡萄球菌的基因可塑性有关。本研究对临床野生型（101）及相应SCV（102）,临床野生型诱导 SCV（SXT-101,G-101）,临床 SCV 回复株（102-Reverse）,和临床野生型（107）及相应临床SCV（106）,临床SCV回复株（106-Reverse）进行全基因组测序。结果发现,菌株表型与基因之间存在明显的关联:（1）临床分离SCV102及106均显示喹啉/醌代谢相关基因menA的碱基缺失,可能导致蛋白表达提前终止。（2）与野生株相比,庆大霉素诱导的SCV菌株G-101在基因menB处出现碱基位点突变;SXT诱导的SCV菌株SXT-101在代谢相关基因MW1485和aroA处分别出现基因片段的缺失和插入,该现象为首次发现。（3）大部分SCV在毒力相关基因spa,clfB,MW2416上显示突变,而存在于SCV菌株102及106的MW2095基因上的缺失可能与其耐药特性相关。（4）与野生株相比,回复株102-Reverse和106-Reverse分别在代谢相关基因menA二次突变,在毒力相关基因MW2416内逆转为野生型序列,可能完全或部分地恢复导致SCV表型的突变基因的功能。

关键词：奶牛慢性乳房炎金黄色葡萄球菌SCV 人工诱导表型回复特性研究全基因组测序

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