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益生菌大肠埃希菌Nissle1917鞭毛蛋白的结构分析及表位预测

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中国生物制品学杂志 2022年第6期35卷 672-677页

作者：杨颖邓永军张进区炳明朱国强文明贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵州贵阳550025 肇庆学院生命科学学院广东肇庆526061 扬州大学兽医学院江苏扬州225009

目的分析益生菌大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)鞭毛蛋白(FliC)的结构,并预测其B和T细胞表位。方法从GenBank数据库中获取EcN FliC的氨基酸序列。应用ProtParam在线工具分析EcN FliC理化特性,Protscale在线工具分析亲疏水性,PSIPRED软件及DN... 详细信息

目的分析益生菌大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)鞭毛蛋白(FliC)的结构,并预测其B和T细胞表位。方法从GenBank数据库中获取EcN FliC的氨基酸序列。应用ProtParam在线工具分析EcN FliC理化特性,Protscale在线工具分析亲疏水性,PSIPRED软件及DNAstar软件预测分析二级结构,I-TASSER在线软件预测三级结构,DNAstar在线工具中Protean软件和ABCpred软件综合预测B细胞抗原优势表位,细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,CTL)表位预测网站预测T细胞表位。结果EcN FliC的相对分子质量为60937.57,化学分子式为C_(2584)H_(4201)N_(745O940)S_(6),不稳定指数为15.23;亲水性平均值为-0.324,为亲水性蛋白;α螺旋及无规则卷曲是EcN FliC二级结构中的主要结构;预测的三级结构模型具有正确的结构拓扑,可信度高;共筛选出13个B细胞优势表位及3个CTL优势表位。结论EcN FliC特征分析及表位预测结果为其作为免疫佐剂的应用奠定了基础。

关键词：大肠埃希菌鞭毛蛋白生物信息学理化性质结构分析表位预测

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位预测

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生物医学工程学杂志 2016年第2期33卷 325-331页

作者：王东方白雪娟刘银萍梁艳吴雪琼林明贵河北北方学院张家口075000 解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室北京100091

本文应用生物信息学技术预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位,为结核病的诊断和疫苗研发筛选合适的抗原靶位。通过Blast分析发现Rv2004c蛋白与人类蛋白的同源性较低;采用DNAStar软件包中的Protean软件分析其二级结构、... 详细信息

本文应用生物信息学技术预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位,为结核病的诊断和疫苗研发筛选合适的抗原靶位。通过Blast分析发现Rv2004c蛋白与人类蛋白的同源性较低;采用DNAStar软件包中的Protean软件分析其二级结构、亲水性、抗原性、柔韧性及表面可能性,预测该蛋白有10个候选B细胞抗原表位;应用RANKPEP及SYFPEITHI法预测该蛋白有37个候选Th细胞抗原表位,主要位于第200位氨基酸之后,其中HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*0701表型相对的表位数目较多且某些候选表位的主要组织相容性复合体(MHC)限制类型存在交叉重叠;应用SYFPEITHI法、BIMAS法及NetCTL法预测该蛋白有10个候选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,其中以HLA-A2限制性表位数目较多、分值较高。由此得出结论:Rv2004c蛋白含有较多潜在的T细胞和B细胞抗原表位,可作为新的结核病诊断试剂和疫苗研发的候选靶蛋白。

关键词：结核分枝杆菌 Rv2004c 表位预测生物信息学

弓形虫天冬氨酸蛋白酶2(TgASP2)的生物信息学分析及多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2023年第15期 18-24,129,130页

作者：孙晓敬田甜马茜张磊李薇姚佳汪洋西安医学院基础医学部病原生物学教研室西安710021

为了预测分析弓形虫天冬氨酸蛋白酶2(TgASP2)的生物结构及功能,并制备多克隆抗体,试验首先采用生物信息学软件对TgASP2蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点及B、T淋巴细胞抗原表位等进行分析,然后构建... 详细信息

为了预测分析弓形虫天冬氨酸蛋白酶2(TgASP2)的生物结构及功能,并制备多克隆抗体,试验首先采用生物信息学软件对TgASP2蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点及B、T淋巴细胞抗原表位等进行分析,然后构建原核表达载体,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化重组蛋白,再免疫大鼠制备特异性多克隆抗体。结果表明:TgASP2蛋白的分子式为C_(2296)H_(3588)N_(626)O_(661)S_(24),等电点为7.22,为亲水性稳定蛋白;N端第1~19位氨基酸为信号肽序列,无跨膜结构域,共有37个磷酸化位点;具有14个B淋巴细胞线性表位、4个CTL细胞抗原表位及3个Th细胞抗原表位。试验成功构建出重组质粒pET-28a(+)-TgASP2,获得了可溶性重组蛋白rTgASP2;成功制备出多克隆抗体,且制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgASP2蛋白,抗体效价高达1∶128000。说明TgASP2蛋白具有一定的免疫原性,能引发良好的免疫应答。

关键词：弓形虫天冬氨酸蛋白酶2 生物信息学分析表达载体表位预测多克隆抗体

大豆球蛋白G5A3亚基多肽链抗原表位的预测及分段克隆载体的构建

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粮食与油脂 2022年第10期35卷 120-125页

作者：陈慧彬席俊河南工业大学粮油食品学院河南郑州450001

为进一步探究大豆球蛋白G5亚基中A3多肽链的抗原表位,现利用DNAstar、SOPMA、Disco Tope 2.0 Sever 3个生物信息学软件对其进行抗原表位的预测。结果显示:3个预测软件均包括的序列为^(90)FEK-LQD^(109)、PDI、PETMQQ、^(181)QQQ-EEE^(2... 详细信息

为进一步探究大豆球蛋白G5亚基中A3多肽链的抗原表位,现利用DNAstar、SOPMA、Disco Tope 2.0 Sever 3个生物信息学软件对其进行抗原表位的预测。结果显示:3个预测软件均包括的序列为^(90)FEK-LQD^(109)、PDI、PETMQQ、^(181)QQQ-EEE^(200)、PDDERK、PKW。在NCBI网站查询A3多肽链的基因序列和蛋白质序列,共960 bp, 320 aa。综合预测结果将A3多肽链重叠分段,经PCR获取分段目的基因,连接转化、PCR和双酶切结果显示重组载体构建成功,为研究大豆球蛋白G5A3多肽链的分段表达和抗原表位的精准筛选提供参考。

关键词： G5A3多肽链生物信息学表位预测重叠分段克隆载体

牛病毒性腹泻病毒多表位基因疫苗的构建及其免疫效果评价

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畜牧与兽医 2022年第10期54卷 102-110页

作者：赵微张东超陈婷何敬文扈立伟任君卢宝平刘青包利霞顾天越金天明天津农学院动物科学与动物医学学院天津300384 天津市农业科学院天津300192

旨在构建牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)多表位基因与BVDV结构蛋白E0、E2基因的表达载体并检测其免疫效果。从NCBI上获得BVDV的4种具有免疫原性的结构蛋白C、E0、E2、NS3基因序列,利用生物学方法预测其B、T细胞表... 详细信息

旨在构建牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)多表位基因与BVDV结构蛋白E0、E2基因的表达载体并检测其免疫效果。从NCBI上获得BVDV的4种具有免疫原性的结构蛋白C、E0、E2、NS3基因序列,利用生物学方法预测其B、T细胞表位;将获得的序列进行连接,重组获得新肽段(命名为AKK),通过生物学在线软件分析AKK序列的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构;PCR分别扩增上述基因序列,构建重组表达载体GV658-AKK-E0-E2、GV658-AKK、GV658-E0、GV658-E2,并将上述构建成功的无内毒素重组质粒转染至MDBK细胞,通过蛋白免疫印迹。经PCR扩增获得2910、1170、951和729 bp大小的目的条带,与预计相符;经蛋白免疫印迹验证,在34和68 kDa处有AKK蛋白及E0-E2蛋白的融合表达;经流式细胞术验证显示,在CD3^(+)、CD4^(+)细胞占比上,共表达组极显著高于PBS组,显著高于E0组,与ELISA检测IgG抗体水平结果一致。研究表明,试验成功设计了BVDV多表位序列AKK,并成功构建真核表达载体,AKK、E0、E2蛋白高效表达,共表达组能更好地刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答。

关键词： BVDV 表位预测 E0基因 E2基因

热加工破坏大豆球蛋白G1A1a致敏表位的定位

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热加工破坏大豆球蛋白G1A1a致敏表位的定位

作者：付杨河南工业大学

学位级别：硕士

大豆因其较高的油脂含量和优质蛋白质被广泛种植,制作成饲料及各类副产品。但是大豆也是联合国粮农组织认定的八大过敏原之一,极大的影响着敏感人群的生命健康。因此深入探究大豆蛋白的致敏机理,精确定位出致敏位点可以为低致敏性产品... 详细信息

大豆因其较高的油脂含量和优质蛋白质被广泛种植,制作成饲料及各类副产品。但是大豆也是联合国粮农组织认定的八大过敏原之一,极大的影响着敏感人群的生命健康。因此深入探究大豆蛋白的致敏机理,精确定位出致敏位点可以为低致敏性产品的研发提供依据,同时研究降低大豆致敏性的加工方法,对于大豆过敏患者具有深远意义。本文以大豆球蛋白G1亚基A1a酸性多肽链(以下称为G1A1a)为研究对象,通过数据库索引获得氨基酸序列,以G1A1a的同源蛋白质为依据建立其三维结构模型,并对该模型的线性表位和构象表位进行预测,结合亲水性、表面可及性和抗原性等性质预测出了10个线性表位和部分构象表位。10个可能性较高的线性表位为:EQPQ QN、KPDNRI、NPNNK、RRPSYTNG、PQQPQQRGQS、QEQGG HQSQKGKHQQEEENE、NEGED、PPTDEQQQRP、DEKPQCKGK、RPRGS。预测结果分析:β-折叠和无规则卷曲位置有较大的可能性成为抗原表位。结合预测表位,采用重叠分段(overlapping)的方法将G1A1a的氨基酸序列分为A1a-1、A1a-2和A1a-3三段,并设计每条分段的引物。将PCR扩增后的G1A1a基因和重叠片段基因进行胶回收,回收片段与T载体连接构建成克隆载体,转化后挑选阳性菌扩大培养提取质粒,质粒双酶切后与T7噬菌体臂连接,将连接后的载体经过体外包装侵染大肠杆菌,使得目的基因能够正常表达。富集纯化表达的噬菌体蛋白,为后续免疫学检测实验做准备。将足量的热加工处理大豆球蛋白与兔源大豆球蛋白多克隆抗体混合吸收,制备热加工蛋白的特异性抗体。特异性抗体与噬菌体表达蛋白进行ELISA反应,定位出热加工破坏的优势抗原表位位于片段A1a-2上。将片段A1a-2进行重叠分段,分为A1a-2-A、A1a-2-B、A1a-2-C三段,对重叠分段再次进行PCR扩增,克隆载体、表达载体的构建,得到噬菌体表达蛋白,免疫反应结果显示片段A1a-2-B含有热加工破坏抗原优势表位。为进一步缩小热加工破坏抗原优势表位所在区域,进行最终一轮的重叠分段,将片段A1a-2-B分为片段A1a-2-B-Ⅰ、A1a-2-B-Ⅱ、A1a-2-B-Ⅲ。结果显示热加工破坏抗原优势表位位于片段A1a-2-B-Ⅰ,该片段氨基酸序列为SLENQLDQMPRRFYLAGNQEQEFLKYQQEQG。将三次overlapping分段筛选出的优势抗原表位与大豆过敏患者Ig E抗体进行ELISA反应鉴定致敏性,结果显示:三段抗原优势表位噬菌体表达蛋白均与大豆过敏患者Ig E抗体产生阳性反应,即确定片段A1a-2-B-Ⅰ为G1A1a的优势致敏表位区域。通过在线软件分析,显示该片段含有51.61%的无规则卷曲,其结构分布符合表位预测时所得出的结论。对确定出的热加工破坏致敏优势表位区域进行精确定位:将片段A1a-2-B-Ⅰ分为重叠的三段进行多肽合成,经过斑点印记(Dot-blot)实验,结果表明只有肽2能够与兔源大豆球蛋白多克隆抗体呈阳性反应,即证明肽2中含有对应的线性表位,肽1与肽3中不含有相关线性表位,ELISA反应结果同Dot-blot实验结果一致。而热加工破坏的特异性抗体与三条多肽均不反应,则表明热加工处理对多肽中的线性表位没有产生破坏。而片段A1a-2-B-Ⅰ噬菌体表达蛋白能与热加工破坏特异性抗体结合反应,则证明片段A1a-2-B-Ⅰ中含有热加工破坏的构象表位。将合成多肽与大豆过敏患者Ig E抗体反应结果显示只有肽2呈阳性,表明肽2具有致敏表位。将肽2中的氨基酸逐个使用丙氨酸进行替换合成突变多肽,氨基酸突变后的多肽与BSA偶联,经过Dot-blot和ELISA实验,结果显示D、Q、M、Y是影响大豆球蛋白G1A1a抗原性的关键氨基酸。而Q、M、R、N是影响大豆球蛋白G1A1a致敏性的关键氨基酸。

关键词： G1A1a 表位预测重叠分段噬菌体展示

结核分枝杆菌α晶体蛋白(Rv2031c)的T、B细胞抗原表位在线分析

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细胞与分子免疫学杂志 2018年第5期34卷 408-413页

作者：刘娜孟祥英李恒乔晋娟潍坊医学院山东潍坊261053

目的预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白α晶体蛋白(Rv2031c)的抗原表位。方法 BLAST在线分析Rv2031c与人类蛋白的同源性;利用DNAStar软件包中的Protean模块预测其B细胞和T细胞抗原表位;RANKPEP和SYPEPITHI在线预测辅助性T(Th)细胞抗原表... 详细信息

目的预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白α晶体蛋白(Rv2031c)的抗原表位。方法 BLAST在线分析Rv2031c与人类蛋白的同源性;利用DNAStar软件包中的Protean模块预测其B细胞和T细胞抗原表位;RANKPEP和SYPEPITHI在线预测辅助性T(Th)细胞抗原表位;SYFPEPI、BIMAS和Net CTL方法在线预测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。结果 Rv2031c与人类蛋白同源性较低,有8个潜在的B细胞抗原表位,7个候选Th细胞抗原表位和3个候选CTL表位。结论 Rv2031c含有较多潜在的人类B细胞、Th细胞和CTL抗原表位,可作为新的结核病疫苗研发的候选靶蛋白。

关键词：生物信息学结核分枝杆菌表位预测 α晶体蛋白(Rv2031c)

荆州地区HPV51型E6/E7/L1基因多态性分析及表位预测

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荆州地区HPV51型E6/E7/L1基因多态性分析及表位预测

作者：叶梦霞长江大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)易感染肛门-生殖器,是常见的性传播疾病病原体之一,根据HPV感染后的临床表现和疾病转归可将其分为高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)和低危型人乳头瘤病毒(low risk hu... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)易感染肛门-生殖器,是常见的性传播疾病病原体之一,根据HPV感染后的临床表现和疾病转归可将其分为高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)和低危型人乳头瘤病毒(low risk human papillomavirus,LR-HPV)。其中HR-HPV持续感染与宫颈癌的发生发展密切相关。HPV感染在世界范围内均有分布,但其发生率和优势亚型在不同地区存在差异。宫颈癌是全球妇女排名第四的癌症,对世界女性造成严重危害。一级预防(预防性HPV疫苗接种)和二级预防(HPV筛查和宫颈癌前病变治疗)能有效控制宫颈癌的发生和发展。规范接种HPV预防性疫苗可诱导机体产生针对HPV表位的广泛多克隆免疫应答,目前已上市的二价、四价、九价HPV疫苗均为基于L1蛋白免疫原性的预防性疫苗。HPV51型是α-5属的HR-HPV,在世界范围内许多地区的流行率排名靠前,但其并未被包括在目前市面上的HPV预防性疫苗之中。而预防性疫苗仅针对疫苗所覆盖的HPV型别产生特异性中和抗体,对已经发生的感染和已产生癌变的细胞没有治愈作用。以E6、E7为靶点的治疗性疫苗可以填补这方面的缺憾。然而,HPV变异可能影响病毒的传染性、致病性、致瘤性、病毒颗粒组装和宿主免疫应答。故研究HPV的基因多态性对HPV疫苗的设计和宫颈癌的防治有重要意义。目的本研究拟通过分子生物学方法研究HPV51型E6、E7和L1基因多态性,明确荆州地区HPV51型的基因变异特征,为研发诊断探针、治疗或预防疫苗的研究提供基础资料。方法收集长江大学附属荆州医院在2018年1月至2021年3月期间行高危HPV分型检查患者的宫颈脱落细胞样本,通过荧光定量PCR方法将其分型,并筛选出单一HPV51型感染的样本。通过PCR方法将HPV51型单一阳性样本的E6、E7和L1基因进行扩增、测序,所得序列与Gen Bank参考序列比对。利用MEGA-X分析基因突变位点并构建系统发育树。利用PAML-X进行选择压力分析。利用IEDB和ABCpred在线软件分别预测E6、E7蛋白的T细胞表位和L1蛋白的B细胞表位。结果1.E6-E7序列中出现14个单核苷酸变异,其中4个为非同义突变,10个为同义突变。E6中的T86P、S100L分别位于E6序列二级结构的α螺旋和β折叠上;E7中的F29L和S66L均位于其二级结构的无规则卷曲上。E6中的T86P、S100L和E7中的F29L这三种非保守性替换影响了多个预测的T细胞表位。最优秀的T细胞表位分别为E6的86-94 TTLEAITKK和E7的86-94 MLMGELSLV。在多个等位基因上均表现出较强亲和力的表位是E6基因的95-105 SLYDLSIRCHR和E7的7-15 QLKDVVLHL。2.在L1序列中共鉴定出41个单核苷酸变异,包括10个非同义突变和31个同义突变。非同义突变I52L/I52V位于BC环,N176S位于EF环,V264G、G265S、D273N/D273E位于FG环,T354P位于HI环。这些氨基酸的变化可能会影响L1蛋白的抗原性。L1中的两个非保守替换,即H119Y和N176S,影响了多个预测的B细胞表位。26-41TRTGIYYYAGSSRLIT和287-302ESYIYSATPSGSMITS是L1序列亲和力最强的B细胞表位。3.所有E6-E7和L1的序列均归属于A型变异谱系,这与既往的研究结果一致。通过选择压力分析,在HPV51型E6、E7和L1序列中均未发现阳性选择位点。结论1.荆州地区高危型HPV感染率为20.05%,感染率高的前5位HPV型别依次为HPV52型、HPV58型、HPV16型、HPV68型和HPV51型。2.E6-E7基因序列中4个为非同义突变,10个为同义突变,部分非同义突变对应的氨基酸变化会影响T细胞表位预测的结果。3.L1基因序列中共鉴定出41个单核苷酸变异,包括10个非同义突变和31个同义突变,其中多个突变对应的氨基酸残基位于loop环上,部分非同义突变对应的氨基酸变化会影响B细胞表位预测的结果。4.通过表位预测发现的亲和力强的E6、E7 T细胞表位和L1 B细胞表位,可为后续研究治疗性HPV疫苗和广谱预防性疫苗提供重要信息。

关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒51型变异表位预测 HPV疫苗

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基于点云架构的B细胞表位预测研究

基于点云架构的B细胞表位预测研究

作者：于洋东北师范大学

学位级别：硕士

免疫信息学是在现代信息学和免疫学的基础上建立的新兴学科,它是一种使用信息学的相关方法理论来处理免疫和疫苗学相关问题的学科,同时也是研究生物免疫应答过程中信号传输规律以及免疫系统调节的学科。作为免疫信息学研究的主要问题之... 详细信息

免疫信息学是在现代信息学和免疫学的基础上建立的新兴学科,它是一种使用信息学的相关方法理论来处理免疫和疫苗学相关问题的学科,同时也是研究生物免疫应答过程中信号传输规律以及免疫系统调节的学科。作为免疫信息学研究的主要问题之一,表位预测是研究疫苗、抗体、变态反应和移植免疫计算分析的基础。表位是在抗原分子中能够与抗体或受体结合、引发特异性反应,从而引发免疫应答的特殊化学结构。B细胞表位是指抗原表面上,能够被B细胞受体或抗体特异性识别,并在体液免疫反应中诱导抗体的特定区域。识别B细胞表位有助于设计出更为安全高效的抗原疫苗与抗体,有助于疾病的预防和诊断。目前已有一些鉴定表位的实验方法,包括蛋白质晶体学和核磁共振技术等,但这些方法通常价格昂贵且耗时较长。因此,一些基于计算的方法被开发出来用于辅助或为试验方法提供依据。现有基于计算的B细胞表位预测方法主要有基于抗原序列、基于模拟表位和基于抗原3D序列的预测,根据表位相关特征属性,采用丰富的计算策略识别表位位点。近年来,随着公开的蛋白质3D结构的数据及预测蛋白质结构的方法的增加,基于抗原结构的预测方法得到了迅速的发展。本文利用抗原蛋白的三维结构,构建基于原子的抗原蛋白点云架构,得到基于点云架构的B细胞表位预测工具。点云架构可以很好地体现并利用蛋白质的三维结构数据,并学习蛋白质的几何属性。为了提取蛋白质更细微的特征,本文基于原子层面进行建模,以原子的理化属性和蛋白质序列的进化信息作为输入特征,使用PPFConv的点云网络得到局部几何编码后进行特征的学习,并且使用多尺度分组学习不同感受野的特征。得到原子层面的表征后聚合到残基层面进一步学习残基层面的信息,实现蛋白质上不同尺度不同层面的特征学习。本文方法在独立测试集上的AUC达到了0.735,AP达到了0.435,与其他工具对比,性能上显示出了明显的优势。本文选取了与HIV-Ⅰ密切相关的gp120抗原蛋白和与甲型流感病毒密切相关的HA1抗原蛋白进行案例分析,本文方法在这两条蛋白上均有着较好的表现。由此看出,本文提出的基于点云架构的B细胞表位预测工具有着较好的预测能力,可为后续疫苗的设计和疾病的预防等提供帮助。

关键词： B细胞表位表位预测蛋白质三维结构点云