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内源性FGF21通过FGFR1/PI3K/Akt通路减轻MCAO大鼠延迟血管再通后半暗带的血脑屏障损伤

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中南大学学报（医学版） 2023年第5期48卷 648-662页

作者：郑文李文君曾旖旎袁慧阳衡陈茹朱安定吴金泽宋治严文广中南大学湘雅三医院神经内科长沙410013 中南大学湘雅三医院康复科长沙410013

目的:在“时间窗”内恢复闭塞大动脉的血流是急性缺血性卒中的主要治疗策略。既往研究表明“时间窗”后的血管再通治疗可导致严重的缺血/再灌注损伤。然而,大量临床证据提示“时间窗”后的血管再通治疗仍可改善急性缺血性卒中的神经功... 详细信息

目的:在“时间窗”内恢复闭塞大动脉的血流是急性缺血性卒中的主要治疗策略。既往研究表明“时间窗”后的血管再通治疗可导致严重的缺血/再灌注损伤。然而,大量临床证据提示“时间窗”后的血管再通治疗仍可改善急性缺血性卒中的神经功能转归。本研究探讨大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)后血管再通治疗对缺血半暗带血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的影响及分子机制。方法:MCAO后第3天行血管再通治疗术,通过蛋白质印迹法、伊文思蓝染色和免疫荧光染色检测BBB损伤。MCAO后第7天评估梗死体积和神经功能转归。采用免疫荧光染色和/或蛋白质印迹法观察缺血半暗带中成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)和丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,Akt)的表达及其对BBB的影响。结果:MCAO后缺血半暗带伊文思蓝、IgG和白蛋白的外渗增加,但在血管再通后显著下降;Claudin-5、Occludin和紧密连接蛋白ZO-1表达降低,但在血管再通后表达升高,与FGF21、p-FGFR1、PI3K和p-Akt蛋白升高一致。MCAO后第7天,梗死体积缩小,神经功能改善。侧脑室注射FGFR1抑制剂SU5402可下调缺血半暗带区PI3K、p-Akt、Occludin、Claudin-5和ZO-1的表达,减弱血管再通治疗对MCAO大鼠神经功能转归的有利作用。结论:MCAO后第3天的血管再通治疗增加缺血半暗带内源性FGF21的表达,并可通过激活FGFR1/PI3K/Akt通路减轻缺血半暗带BBB损伤,改善MCAO大鼠的神经功能。

关键词：大脑中动脉闭塞成纤维细胞生长因子21 延迟血管再通缺血/再灌注损伤血脑屏障损伤

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外周血中血脑屏障损伤新型标记物脑微血管内皮细胞检测方法的建立

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南方医科大学学报 2014年第12期34卷 1733-1737页

作者：李妍杜蕾袁霖陈德喜邱嘉文何肖龙曹虹黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广东广州510515 首都医科大学附属北京佑安医院北京100069 美国南加州大学洛杉矶儿童医院Saban研究所美国洛杉矶90027

目的建立检测人血脑屏障(BBB)损伤新型标记物外周循环血中脑微血管内皮细胞(c BMECs)的实验方法。方法选取33名AIDS脑病病例与13名健康对照分组实验,应用免疫磁珠吸附AIDS脑病病例组及健康对照组外周血中内皮细胞后涂片,免疫荧光三重染... 详细信息

目的建立检测人血脑屏障(BBB)损伤新型标记物外周循环血中脑微血管内皮细胞(c BMECs)的实验方法。方法选取33名AIDS脑病病例与13名健康对照分组实验,应用免疫磁珠吸附AIDS脑病病例组及健康对照组外周血中内皮细胞后涂片,免疫荧光三重染色法检测涂片中的c BMECs及相关内皮细胞(c ECs和EPCs),并观察其与BBB损伤的关系。结果免疫荧光三重染色法成功检测到细胞型为CD146+/CD133-/S100B+的c BMECs细胞,CD146+/CD133-/S100B-的c ECs细胞和CD133+/CD146+/S100B-的EPCs细胞。结果显示,病例组三种细胞含量均高于对照组,差别有统计学意义(c BMECs、c ECs、EPCs分别为t=4.298,P损伤新型标记物c BMECs的实验方法。BBB损伤病人外周血中c BMECs含量显著高于健康人。新型标记物c BMECs在无创检测BBB损伤方面具有重要临床价值。

关键词：外周血生物标记物脑微血管内皮细胞血脑屏障损伤

NEK7在蛛网膜下腔出血后血脑屏障损伤中的作用与机制的研究

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NEK7在蛛网膜下腔出血后血脑屏障损伤中的作用与机制的研究

作者：李根大连医科大学

学位级别：硕士

背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科常见的一种具有极高的致死致残率的急性出血性脑卒中,近年来大量研究表明NIMA相关激酶7(NEK7)参与了核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体(NLRP3炎性小体)相关的炎症... 详细信息

背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科常见的一种具有极高的致死致残率的急性出血性脑卒中,近年来大量研究表明NIMA相关激酶7(NEK7)参与了核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体(NLRP3炎性小体)相关的炎症反应,从而引起神经细胞及血管损伤。本研究的目的即研究NEK7在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及其潜在的作用机制。方法:本研究共使用了455只体重在22-30g的雄性成年C57B6J小鼠以研究SAH后患侧大脑皮层中NEK7表达的时间空间分布、功能和潜在机制。SAH模型制作采取血管内线穿法制作,NEK7重组蛋白、NEK7 si RNA、尼日利亚霉素及MCC950以侧脑室注射方式转至SAH小鼠模型体内,后进行改良加西亚评分与平衡木实验等神经功能评分评价小鼠神经功能损伤情况,进行干湿法测定脑水含量、依文思蓝渗漏实验、冰冻切片免疫荧光和Western Blot等实验评价小鼠血脑屏障损伤情况,进行TUNEL染色及Western Blot评价SAH后患侧大脑皮层的神经元凋亡情况,进行免疫荧光染色评估小胶质细胞的聚集与激活,并研究NEK7与NLRP3炎性小体间的作用机制。结果:SAH后内生性NEK7在患侧大脑皮层的表达量升高,并广泛分布于小胶质细胞、血管内皮细胞、神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞中,其中在患侧皮层中的血管内皮细胞及小胶质细胞中高表达。转导外源性NEK7重组蛋白可加重小鼠模型的神经功能损伤、脑水含量、神经元凋亡和血脑屏障损伤、诱导小胶质细胞聚集,并促进半胱胺酸天冬氨酸水解酶1(caspase-1)的活化,最终引起下游因子白细胞介素-1beta(interleukin-1β,IL-1β)的活化;而转导NEK7 si RNA则表现出与NEK7重组蛋白相反的作用,NEK7 si RNA可减轻小鼠神经功能损伤、脑水含量、神经元凋亡和血脑屏障的损伤程度。一种NEK7/NLRP3通路的激活剂——尼日利亚霉素的应用可促进凋亡相关点样蛋白(ASC)的寡聚化和caspase-1、IL-1β的活化,但同时对NLRP3的表达无明显的影响;然而在对内生性NEK7进行敲减后再应用尼日利亚霉素或直接使用一种NEK7/NLRP3通路的抑制剂——MCC950则可抑制ASC的寡聚化和caspase-1、IL-1β的活化。故本研究得出的结果:SAH后NEK7的表达增高,尤其在皮层中的血管内皮细胞及小胶质细胞中呈高表达,且NEK7可激活下游的NLRP3通路使caspase-1与IL-1β活化,引起血脑屏障损伤与开放、小胶质细胞聚集与活化,最终引起神经元凋亡,造成神经功能损伤。总结:本研究表明NEK7可能通过NEK7/NLRP3通路诱导SAH后的血脑屏障损伤和神经元凋亡,最终导致神经功能损伤,且NEK7是SAH后NLRP3炎性小体激活过程的重要因子,是SAH患者治疗的一个具有前景的潜在靶点。

关键词：蛛网膜下腔出血 NIMA相关激酶7 NLRP3炎性小体血脑屏障损伤小胶质细胞

大鼠脑缺血早期cav-1、MMP-2/9、紧密连接蛋白的表达和血脑屏障损伤的关系

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大鼠脑缺血早期cav-1、MMP-2/9、紧密连接蛋白的表达和血脑屏障损...

作者：钟巍中南大学

学位级别：硕士

目的：探讨大鼠脑缺血早期脑组织中小凹蛋白-1(cav-1)、基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)和紧密连接蛋白(claudin-5、occludin)的表达变化与早期血脑屏障(BBB)损伤之间的关系。方法：将72只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、缺血1.5h组、缺... 详细信息

目的：探讨大鼠脑缺血早期脑组织中小凹蛋白-1(cav-1)、基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)和紧密连接蛋白(claudin-5、occludin)的表达变化与早期血脑屏障(BBB)损伤之间的关系。方法：将72只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、缺血1.5h组、缺血3h组和缺血4.5h组,缺血组通过线栓法制备大脑中动脉阻塞模型,假手术组同样分离结扎血管,栓线插入颈内动脉,但不阻塞大脑中动脉。每组再随机分为2个亚组,分别进行伊文思蓝染色和免疫组化实验。各时间终点处死大鼠,TTC染色及神经行为学评分评价模型成功与否;伊文思蓝含量检测评价血脑屏障通透性改变;免疫组化分别检测cav-1、MMP-2/9、claudin-5和occludin的表达。结果：脑缺血后,大鼠出现神经功能缺损症状,TTC染色证实MCAO模型成功;脑组织缺血早期(4.5h内),缺血侧伊文思蓝含量明显增加,免疫组化显示cav-1和MMP-9表达上调,claudin-5表达下调,而MMP-2和occludin无明显表达变化。结论：大鼠缺血性脑损伤早期,MMP-9上调和claudin-5降解参与了早期血脑屏障损伤,MMP-9的快速激活或分泌可能与cav-1有关,而MMP-2和occludin与缺血早期血脑屏障损伤无明显相关。

关键词：脑缺血血脑屏障损伤小凹蛋白-1(Cav-1) 基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9) 紧密连接蛋白(Claudin-5 Occludin)

miR-21-3p在创伤性血脑屏障损伤中的作用机制研究

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miR-21-3p在创伤性血脑屏障损伤中的作用机制研究

作者：李文竹天津医科大学

学位级别：硕士

研究目的:创伤性颅脑损伤(TBI)是世界范围内重要的公共卫生问题,其所致的继发性损伤会加剧认知功能障碍的发生发展,与TBI的预后密切相关。创伤性血脑屏障损伤是TBI后脑组织病变进展的关键环节。我们团队近期研究发现,创伤性脑损伤(TBI)... 详细信息

研究目的:创伤性颅脑损伤(TBI)是世界范围内重要的公共卫生问题,其所致的继发性损伤会加剧认知功能障碍的发生发展,与TBI的预后密切相关。创伤性血脑屏障损伤是TBI后脑组织病变进展的关键环节。我们团队近期研究发现,创伤性脑损伤(TBI)后脑内miR-21-5p表达水平升高,从而通过减轻血脑屏障(BBB)损伤来改善神经功能。miR-21-3P是另一种成熟miRNA,来源于除了miR-21-5p之外的Pro-miR-21。近年来,它在肿瘤、心肌病等各种疾病中的作用引起了人们的极大兴趣。为了进一步探讨miR-21,尤其是miR-21-3p在TBI后BBB损伤中的作用及其机制。本篇文章主要目的是研究miR-21-3P对脑微血管内皮(BMVECs)凋亡和炎症的影响。材料与方法:体内实验:采用小鼠大脑可控皮质冲击(CCI)模型;CCI后BMVECs中miR-21-3p水平的时间分布;miR-21-3p寡聚体内治疗;伊文思蓝(EB)渗出试验;体内紧密连接蛋白检测;神经预后评估;体外实验:采用了b End.3细胞糖氧剥夺(OGD)模型;细胞培养及小鼠脑内皮细胞(b End.3)的鉴定;离子电导显微镜(HPICM)扫描紧密连接;OGD处理后b End.3细胞miR-21-3p水平的时间分布;分组及miR-21-3p生化聚缩合体的转染;辣根过氧化物酶(HRP)通量测定;体外紧密连接蛋白检测;细胞死亡检测;ELISA法检测炎症介质;荧光素酶报告试验;短发夹RNA(Sh RNA)载体转染;定量RT-PCR、免疫印迹、数据分析结果和结论:大脑皮层损伤的小鼠BMVECs和经OGD处理的b End.3细胞的miR-21-3p水平在损伤后均有升高。在体外实验中,将miR-21-3p的抑制剂转染入培养的细胞中下调miR-21-3p水平,缓解OGD带来的血脑屏障(BBB)的损伤,使BBB渗漏减少并且紧密连接蛋白增多。此外miR-21-3p的抑制剂可以通过抗凋亡的作用抑制细胞死亡并且通过抑制NF-κB信号活性来抑制炎症反应。通过荧光素酶检测和MAT2B沉默的sh RNA载体,进一步证明了miR-21-3p通过靶向MAT2B发挥上述功能。体内实验也证实了侧脑室注射miR-21-3P能减轻TBI后血脑屏障的渗漏。减少伊文思蓝外渗,促进紧密连接蛋白的表达,从而促进CCI小鼠神经功能的改善。综上所述,TBI后BMVECs中miR-21-3p的增加不利于血脑屏障的损伤修复。下调损伤脑组织的miR-21-3p水平可能是治疗TBI后血脑屏障损伤的有效方法。

关键词：创伤性脑损伤血脑屏障损伤 miR-21-3p 凋亡炎症继发性脑损伤

外周血中血脑屏障损伤新型标志物cBMECs检测方法的建立和临床应用

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外周血中血脑屏障损伤新型标志物cBMECs检测方法的建立和临床应用

作者：李妍南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景全球范围内中枢神经系统(CNS)疾病的致残率一直居高不下,有调查显示全世界有1/3的人将会有CNS损伤的可能,而且CNS损伤的概率随年龄增加而增加。血脑屏障(BBB)是大脑中枢的天然保护伞,其形态、功能的微小改变皆能给病原入侵... 详细信息

一、研究背景全球范围内中枢神经系统(CNS)疾病的致残率一直居高不下,有调查显示全世界有1/3的人将会有CNS损伤的可能,而且CNS损伤的概率随年龄增加而增加。血脑屏障(BBB)是大脑中枢的天然保护伞,其形态、功能的微小改变皆能给病原入侵中枢神经系统带来可乘之机,BBB相关的疾病所致的住院率和预后时间延长均高于其他疾病。实验研究发现,BBB的损伤在中枢神经系统感染的发生过程中有关键作用。中枢神经系统疾病往往伴随BBB结构和功能的剧烈变化。因此监视、检测BBB的形态、功能的细微变化可以预测中枢神经系统感染损伤,对临床早期诊断、治疗有重要意义,也成为诊断、治疗、预防CNS损伤相关疾病的重要突破点。BBB损伤的定量检测曾经是CNS损伤检测的难点所在。成功分离和培养脑微血管内皮细胞(BMECs,BBB的体外模型)使得BBB损伤的致病机制研究(感染及药物所致)成为可能。过去几十年间,学者们采用了许多体内实验方法检测BBB的功能：循环血中的蛋白(如白蛋白)渗透进入中枢神经系统、中枢神经系统中的蛋白(如S100B)释放入循环血等都用来检测BBB损伤。虽然这些技术都利用了内源性蛋白,但是BBB的破坏可能并非仅与某些特异性结果引起的蛋白水平改变相关。近来基于分子成像技术的MPI在神经科学领域受到广泛关注。虽然学者们在体外实验中使用了许多合成造影剂,但是很少能在活体动物脑部得到稳定结果。神经影像技术的最大难题在于显影剂很少能够成功通过BBB。其他的技术包括注射染色,如依文思蓝染色,注射进入动物模型来检测BBB完整性。这些技术的共同缺憾在于它们都不能被无创地运用于人体。近年来的研究发现,外周血中循环内皮细胞(cECs)的多少可反映因心血管损伤和免疫疾病而引起的血管内皮损伤程度,该技术因其新颖性和无创性备受关注。大多cECs定量程序都包括一道富集步骤：通过磁珠偶联抗体进行免疫磁性分离。在外周血中循环的内皮细胞中,一些是终极分化的细胞(cECs),另外一些是前体样细胞(EPCs),EPCs可能参与诱导引导至靶位点的新血管形成。这些文献更多的讲述cECs在病理条件下被大量检测到,cECs可以作为血管损伤性疾病或某些免疫相关疾病的标志物。由此我们得到启发,既然BBB主要由一种特殊的内皮细胞(BMECs)组成,那么BBB受损后,脱落至循环中的BMECs,即cBMECs,可以看做是BBB损伤的生物标志物。基于BBB损伤和CNS的长期研究,我们假设cBMECs有成熟的BBB细胞型,在CNS的病理改变的脑微血管结构中动态脱落。外周血中的BMECs可以用实验手段进行检测,作为提示BBB损伤的生物标志物。二、研究方法1、磁珠活化与UEAI相偶联吸附外周血内皮细胞称取粘附素UEA-I溶于0.5M pH9.5硼酸盐缓冲液中,以0.2mg/ml比例震荡至充分溶解。加入等体积的浓度为4×108/mL的免疫磁珠,充分混匀后,置于室温充分地颠倒震荡,摇动孵育24小时,使免疫磁珠Dynabeads M-450 Tosylactivated与磁珠包被物Ulex europaeus I (UEA I) lectin充分接触,形成稳定连接复合物。经过孵育,将混合物置于磁力架上,在磁力作用下用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液反复冲洗,弃去上清,借助磁力保留免疫磁珠,洗涤三到五次为宜。弃去上清后的磁珠用含0.1%胎牛血清的0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液重悬,放于4℃保存过夜。次日取出置于4℃的磁珠悬液,放在磁力架上弃去上清液体,用含有5%胎牛血清的Hanks缓冲液重悬磁珠至4×108/mL待用。2、免疫磁珠吸附外周血样本中的目的细胞应用真空采血针采集肘正中静脉血,采集2m1静脉血加入EDTA抗凝管,并在采集后的24小时内进行磁珠吸附。取2mL待测样品外周血液与20mL含有5U肝素的磷酸盐缓冲液与离心管中充分混合。将混合物放入离心机,以3000rpm的转数充分离心5分钟。去除上清后,加入20mL盖氏平衡盐溶液,静置5-10分钟。加入磷酸盐缓冲液后再次离心,转数为3000rpm离心5分钟,如果还有肉眼可见红细胞,可重复一次红细胞溶解步骤。离心后去除上清,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,重悬待用。取已去除红细胞的检测样品与等体积的0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液混合后,混合液置于15mL离心管充分混匀。加入上述己连接活化好的免疫磁珠与样品充分混匀,置于分子杂交仪上旋转震荡使免疫磁充分吸附血液样本中的目的细胞。取出离心管置于磁力架上,在磁力的作用下弃去上清液,用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液反复洗涤3次,用枪头反复冲刷洗涤。重悬至澄清,最终得到50u1液体,涂片后普通显微镜下检测免疫磁珠上是否有细胞吸附。3免疫荧光三重染色法鉴别三种目的细胞将重悬的细胞样本均匀得铺在玻片上

关键词：血脑屏障损伤生物标志物 cBMECs 外周血检测

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血脑屏障损伤的机制研究进展

医学综述 2001年第2期7卷 90-91页

作者：屠永华陈康宁王玉锦第三军医大学西南医院神经内科重庆400038 第三军医大学新桥医院放射科

近10余年来,随着神经影像学的进展,要确切地了解和掌握中枢神经系统(CNS)的影像技术,必须熟悉血脑屏障(BBB)及其病理变化,神经科临床医师熟知BBB的生理解剖,但对其在脑部疾病发病中所起的作用知道甚少.现对有着BBB受损机制以及在CNS某... 详细信息

近10余年来,随着神经影像学的进展,要确切地了解和掌握中枢神经系统(CNS)的影像技术,必须熟悉血脑屏障(BBB)及其病理变化,神经科临床医师熟知BBB的生理解剖,但对其在脑部疾病发病中所起的作用知道甚少.现对有着BBB受损机制以及在CNS某些主要疾病发病机制中所起的作用及进展做一综述.

关键词：血脑屏障损伤神经影像学病理中枢神经系统

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血脑屏障损伤的明胶酶调控研究进展

四川解剖学杂志 2006年第2期14卷 32-34页

作者：王航辉刘曾旭王向东张博贾建强南昌大学医学院人体解剖学教研室江西南昌33000 西安医学院

1 概述MMPs(Matrix Metallopreteinases,MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶,能降解几乎所有细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM),在生理和病理过程中发挥着重要作用.在MMPs中明胶酶A(MMP-2)和明胶酶 B(MMP-9)能降解脑血管内皮细胞基底膜... 详细信息

1 概述MMPs(Matrix Metallopreteinases,MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶,能降解几乎所有细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM),在生理和病理过程中发挥着重要作用.在MMPs中明胶酶A(MMP-2)和明胶酶 B(MMP-9)能降解脑血管内皮细胞基底膜(基底膜在维持血脑屏障通透性方面起重要作用),明胶酶激活后通过调节紧密连接导致血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)开放、脑水肿,脑出血和细胞凋亡.最近研究揭示明胶酶与血脑屏障损伤关系最为密切[1,2].

关键词：血脑屏障损伤明胶酶激活调控研究血脑屏障通透性脑血管内皮细胞蛋白水解酶细胞外基质病理过程

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神经精神狼疮血脑屏障损伤机制的研究进展

医学综述 2020年第19期26卷 3758-3762,3768页

作者：罗玉立杨一帆罗家昂王湘宇付李胤且赵维庆刘爽徐健昆明医科大学第一附属医院风湿免疫科昆明650032

神经精神狼疮(NPSLE)是系统性红斑狼疮患者主要的致命性并发症之一,可以在其病程任意阶段发生,患者可出现头痛、认知障碍、急性意识障碍等一系列神经精神症状。NPSLE发病机制复杂多样,目前尚无单一的致病途径可以解释NPSLE中出现的各种... 详细信息

神经精神狼疮(NPSLE)是系统性红斑狼疮患者主要的致命性并发症之一,可以在其病程任意阶段发生,患者可出现头痛、认知障碍、急性意识障碍等一系列神经精神症状。NPSLE发病机制复杂多样,目前尚无单一的致病途径可以解释NPSLE中出现的各种神经精神症状。血脑屏障损伤被认为是该病的主要发病机制之一,细胞因子、补体系统、自身抗体等在NPSLE的血脑屏障损伤中发挥着重要作用。对于系统性红斑狼疮中血脑屏障损伤机制的研讨,可能为其治疗提供新思路。

关键词：神经精神狼疮血脑屏障损伤机制