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“帕宫”源血糖调节活性肽的分离、鉴定及其构效关系研究

“帕宫”源血糖调节活性肽的分离、鉴定及其构效关系研究

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作者：程秀峰西藏农牧学院

学位级别：硕士

糖尿病已成为最严重的慢性疾病之一。食物蛋白源血糖调节肽的组织亲和力及特异性高、副作用低,能够与血糖调节的受体、酶和生物分子作用。“帕宫”是以整条藏猪肉为原料进行剔骨腌制的发酵肉制品,它是藏族人民对肉类的保藏和运输进行实... 详细信息

糖尿病已成为最严重的慢性疾病之一。食物蛋白源血糖调节肽的组织亲和力及特异性高、副作用低,能够与血糖调节的受体、酶和生物分子作用。“帕宫”是以整条藏猪肉为原料进行剔骨腌制的发酵肉制品,它是藏族人民对肉类的保藏和运输进行实践的硕果。已有研究对西藏林芝区域“帕宫”营养成分及风味物质进行了分析,但是,国内外尚无针对“帕宫”中活性肽段的研究报道。“帕宫”在发酵过程中,蛋白质逐渐酶解形成多种活性肽和氨基酸,是生物活性肽的优秀来源。基于此,本文以“帕宫”肌肉为实验材料,利用胃胰酶消化法和水溶提取法制备粗多肽,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和激光衍射技术研究“帕宫”源粗多肽的理化特性。利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25、反相色谱分离纯化“帕宫”源血糖调节活性肽,随后测定各组分α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性,采用HPLC-异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法分析各组分的氨基酸组成,最后利用液相色谱/串联质谱技术进行序列鉴定。借助Peptide Ranker、Expasy-Peptide Cutter、BIOPEP-UWM数据库、Pep Draw等多种生物信息学手段筛选“帕宫”源血糖调节活性肽序列,通过量子化学计算技术对筛选的肽序列进行结构优化,能量参数以及电荷分布和键长信息的计算,推测出血糖调节活性肽的活性位点。本研究填补了“帕宫”食品功能性研究的空白,探究了肉制品活性肽调节血糖的机制,为开发、改造、人工合成血糖调节肽功能性食品或药物提供理论依据。结果显示,经胃酶处理后,“帕宫”的消化率为46.41±1.23%;经胃酶/胰酶处理后的消化率显著增加至79.11±1.85%。消化法的提取率是水溶法的10倍以上,消化法产物的可溶性肽含量显著高于水溶法（P肽WY和水溶提取粗肽S的泳道蛋白条带都非常浅,蛋白分解程度较高,大分子蛋白质基本全部被分解成11 k Da及以下的多肽。粒径大小及分布变化结果显示,“帕宫”肌肉在消化前后颗粒大小有显著差异,C的体积平均粒径D[4,3]和表面积平均粒径D[3,2]均最大,WY的体积平均粒径D[4,3]最小。采用Sephadex G-25凝胶柱分别分离WY和S。WY的G-25组分分子量大小顺序为WY-Ⅰ>WY-Ⅱ>WY-Ⅲ。S的G-25组分分子量大小顺序为S-1>S-Ⅱ。粒径大小及分布变化结果显示,S-Ⅰ和S-Ⅱ的粒径结果相似,WY-Ⅱ和WY-Ⅲ两个组分的颗粒形状较规则,粒度分布集中。对于α-淀粉酶的抑制活性大小顺序为:WY-Ⅰ>WY-Ⅱ>WY>WY-Ⅲ>S-Ⅱ>S-Ⅰ>S,α-葡萄糖苷酶的抑制活性大小依次为:WY-Ⅱ>WY>WY-Ⅰ>S-Ⅱ>WY-Ⅲ>S>S-Ⅰ,只有WY-Ⅱ的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于60%。利用YMC*GEL ODS C18柱分离WY-Ⅱ收集到三个组分,其疏水性强弱为WY-Ⅱ-3>WY-Ⅱ-2>WY-Ⅱ-1。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性大小顺序均为:阿卡波糖>WY-Ⅱ-3>WY-Ⅱ-2>WY-Ⅱ-1,三个组分α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率均大于60%,且α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着疏水性的增强而增大。根据降糖活性结果,选择对WY-II-3进行序列鉴定。共鉴定出肽序列86条,主要蛋白来源为平滑肌肌动蛋白α2和肌球蛋白-4。在Peptide Ranker程序中评分>0.60的肽序列共筛选出12条,通过Gau ssian 09对序列进行结构优化,肽分子中总能量大小依次是:T1>T12>T2>T9>T8>T10>T7>T6>T5>T11>T3>T4。HOMO轨道多分布在上精氨酸Arg、脯氨酸Pro、赖氨酸Lys、亮氨酸Leu、天冬酰胺Asn、色氨酸Trp和甲硫氨酸Met上。LUMO轨道主要分布在C端氨基酸的-COOH、脯氨酸Pro和苯丙氨酸Phe的苯环上。综合考虑肽分子的HOMO、电荷分布及键长,推测出分子的活性位点,T1位于Arg上的-CH,T2位于Arg上的-CH,T3位于Lys上的-CH,T4位于Pro上的-CH,T5位于Lys上的-CH,T6位于Leu上的-CH,T7位于Pro上的-CH,T8位于Arg上的-CH,T9位于Arg上的-CH,T10位于Trp上的-CH,T11位于Met上的-CH,T12位于Arg上的-CH。

关键词：藏猪肉血糖调节肽分离纯化序列鉴定构效关系

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