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血管芯片的制备及其在肿瘤干细胞诱导的血管新生过程中的初步应用

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血管芯片的制备及其在肿瘤干细胞诱导的血管新生过程中的初步应用

作者：张军东南大学

学位级别：硕士

器官芯片是一种通过微加工工艺、旨在微流控芯片上制作出可以模拟人体组织或器官的主要功能的仿生体系,能够模拟体内器官特异的微环境。随着诸如光刻技术等微加工技术的进步,人们已经能够通过多种方法制作出器官芯片模型。血管系统是人... 详细信息

器官芯片是一种通过微加工工艺、旨在微流控芯片上制作出可以模拟人体组织或器官的主要功能的仿生体系,能够模拟体内器官特异的微环境。随着诸如光刻技术等微加工技术的进步,人们已经能够通过多种方法制作出器官芯片模型。血管系统是人体最基本的组织结构,不仅为体内绝大部分组织器官提供氧气和营养物质,还能够通过生化信号、电生理信号的传导实现与体内微环境的紧密交流和相互作用。尽管目前对肿瘤血管新生的原理知之甚少,然而可以确信它涉及多种促血管生成因子的精细调控。本论文的研究目的就是在芯片中研究肿瘤干细胞对HUVECs成血管的影响,主要研究工作分为以下两部分:1.血管芯片的制备:以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为制作芯片的材料,研究了玻片与PDMS的亲水特性,设计出具有微结构的掩膜版,利用光刻技术制备出模板,在显微镜下检查了光刻微结构,通过反应离子刻蚀技术成功制备出了血管芯片并检测了芯片的可行性。2.血管芯片在肿瘤干细胞诱导的血管新生作用中的应用:肿瘤干细胞的提取和鉴定。从结肠癌HCT-116细胞中提取了肿瘤干细胞,并通过RT-PCR鉴定了干性相关基因Nanog、Sox 2和Oct 4在结肠癌细胞成球后高表达,经过ELISA Kit对比分析了单层细胞和细胞球的VEGF表达水平。芯片中肿瘤干细胞诱导的血管新生。将人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)与鼠尾胶原、纤维蛋白原混合凝胶混匀后,接入到PDMS芯片中的对应通道中,与肿瘤干细胞球进行非接触式共培养,3天后HUVECs形成血管结构,对在多种成血管条件下形成的血管的长度进行了分析。抗血管新生药物作用的鉴定。验证了 HCT-116细胞专属抗癌药Oxaliplatin在不同浓度下对HUVECs的抑制作用。

关键词：器官芯片光刻血管芯片肿瘤干细胞血管新生

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基于微流控技术的血管芯片构建与研究

基于微流控技术的血管芯片构建与研究

作者：王振兴郑州大学

学位级别：硕士

目前,大多数血管组织工程支架内皮化通过体外静态培养内皮细胞来实现。在静态培养条件下形成内皮层的血管支架,当移植入体内后在血流的剪切作用下是否会出现局部内皮层受损却鲜有报道。并且,许多研究中发现,血管组织工程支架表面内皮层... 详细信息

目前,大多数血管组织工程支架内皮化通过体外静态培养内皮细胞来实现。在静态培养条件下形成内皮层的血管支架,当移植入体内后在血流的剪切作用下是否会出现局部内皮层受损却鲜有报道。并且,许多研究中发现,血管组织工程支架表面内皮层细胞的排列情况与对应移植部位正常血管内皮层细胞的排列形式依然有不小差距。为了研究静态培养内皮化组织工程血管聚己内酯(PCL)纤维支架表面内皮层在类人体动脉血流中的完整性及取向性,本文基于微流控技术设计并构建了仿生可拆装的血管芯片及其灌注系统。将构建完成的血管芯片应用于一种新型紫杉醇/左旋聚乳酸纳米粒缓释药物的初步评价。利用3D建模及数值模拟技术对血管芯片结构进行前期设计优化,经过数控雕刻、静电纺丝、热固化成型等多种加工技术制备出芯片的各个模块化部件。采用螺丝紧固连接芯片各部分,实现芯片的可反复拆装,并整体组装芯片及其灌注系统。经数值模拟计算,当血管芯片入口流速为0.75 m/s,芯片单个栅形流道宽度为0.8 mm,流道深度为0.5 mm时,PCL纤维支架上方流体满足人体动脉血流参数,本文所设计的血管芯片内部流体环境接近人体动脉微环境。一系列表征测量结果表明,数控雕刻的加工精度、静电纺丝PCL纤维支架的纤维直径大小及排列均满足预期要求,芯片封装薄膜满足芯片密封性能及生物相容性要求,整体组装后血管芯片及其灌注系统密封性能良好,满足下一步实验要求。将内皮化PCL纤维支架及其它部件无菌组装并运行,完成了血管芯片及其灌注系统的构建。之后利用免疫荧光染色、CCK-8检测等观测手段探究了静态培养内皮化的取向PCL纤维支架和无规PCL纤维支架在类动脉血流条件下是否会出现局部内皮层受损的情况,并进一步地探究了上述两种PCL纤维支架上内皮细胞的取向度。实验结果表明,静态培养内皮化的取向PCL纤维支架和无规PCL纤维支架直接暴露于压强为70 mm Hg,流速为0.5 m/s,对壁面剪切应力为50 dynes/cm的类动脉血流环境中,两种支架表面均会出现局部内皮受损的情况。进一步地,本文利用由低剪切(20 dynes/cm)灌注培养缓慢提升至高剪切(50 dynes/cm)灌注培养的方式,成功实现了静态培养内皮化的取向PCL纤维支架在体外类动脉血流中支架表面内皮层的完整与稳定。此外,本文证明了在接触诱导效应和流动介导的机械传导效应的共同作用下纤维支架表面内皮细胞的排列更加接近正常动脉中内皮细胞的取向排列。根据体外药物释放所需条件,在数值模拟的条件下,更换芯片部分部件并对装置运行条件进行优化。以更新部件后的芯片作为紫杉醇/左旋聚乳酸纳米粒药物初步评价平台,借助光学显微镜、高效液相色谱仪等设备表征观测了纳米粒的分散性、载药率和体外药物累积释放度等主要参数,并使用多种释药模型对紫杉醇累积释放曲线进行拟合,阐明了纳米粒的释药机理。实验结果表明,以左旋聚乳酸包覆紫杉醇形成的纳米粒,使得不溶于水的紫杉醇得以以较大浓度稳定分散于水性环境中。相较于紫杉醇原药,紫杉醇/左旋聚乳酸纳米粒药物持续释放时间长,药物释放平缓,实现了紫杉醇这种细胞周期特异性抗癌药物的持续低剂量释药。释药模型拟合结果表明,紫杉醇/左旋聚乳酸纳米粒药物的释放是紫杉醇的扩散与左旋聚乳酸溶蚀降解的协同作用,药物释放前期以扩散机制为主。

关键词：血管组织工程支架血管芯片内皮层灌注培养取向度药物缓释

基于人体血管B型主动脉夹层的流体仿真及血管芯片的制备

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基于人体血管B型主动脉夹层的流体仿真及血管芯片的制备

作者：易伟劲厦门大学

学位级别：硕士

社会发展带来饮食结构和生活方式的改变,人们在饮食上有了更多的选择,食物上吃的也更加的精细,高糖高热量的饮食以及运动的缺乏都在助推心血管疾病的发生率。在所有的心血管疾病中,相比较而言主动脉夹层是比较高风险的,没有得到及时治... 详细信息

社会发展带来饮食结构和生活方式的改变,人们在饮食上有了更多的选择,食物上吃的也更加的精细,高糖高热量的饮食以及运动的缺乏都在助推心血管疾病的发生率。在所有的心血管疾病中,相比较而言主动脉夹层是比较高风险的,没有得到及时治疗的主动脉夹层患者死亡率可能会高达80%。当血液冲破主动脉内比较薄弱处的血管壁内膜,进入到主动脉内相对薄弱处的血管壁内部,并沿着主动脉的轴向向前延伸,向前延伸产生的空腔被称为假腔,原血管被称为真腔,我们将这种主动脉血管壁的病变称之为主动脉夹层。从主动脉夹层产生的过程,可以得知主动夹层的产生与血液的流动状态有着密不可分的关系。有限元仿真在探究主动脉夹层流体动力学变化时,发挥着积极的作用。单纯的计算机模拟无法直观的观察到血管内皮细胞在血液冲刷下的形貌变化,所以仿真血管的血管芯片开始收到关注。本研究利用有限元分析法对术前不同次级破口模型,及术后封堵模型的流体流线、壁面切应力及壁面压强进行分析,为后续研究此类疾病提供血液动力学上的帮助。利用3D打印、激光刻蚀、静电纺丝等技术制造层流血管芯片、扰流血管芯片、真实形态血管芯片。

关键词： B型主动脉夹层三维重建有限元仿真血管芯片

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基于温敏水凝胶涂层的血管芯片构建与应用

基于温敏水凝胶涂层的血管芯片构建与应用

作者：李嘉劼浙江大学

学位级别：硕士

低温诱导的血管内皮细胞损伤是导致冻疮等肢端病症的主要因素,而血管芯片作为一种体外血管模型,可将血管内皮细胞培养在微流控通道内,并施加灌流剪切力模拟血液流动,常被用于血管的生理与病理研究。但现有血管芯片的通道缺乏温度响应性... 详细信息

低温诱导的血管内皮细胞损伤是导致冻疮等肢端病症的主要因素,而血管芯片作为一种体外血管模型,可将血管内皮细胞培养在微流控通道内,并施加灌流剪切力模拟血液流动,常被用于血管的生理与病理研究。但现有血管芯片的通道缺乏温度响应性,无法模拟肢端微血管收缩的冷应激过程,从而难以准确解析低温对血管内皮细胞的损伤机制。因此,本文首先在芯片的基底材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面制备了细胞相容性良好的温敏水凝胶涂层,并构建仿生肢端微血管的双通道血管芯片;随后,利用该芯片考察了低温对血管内皮细胞功能表达的影响,并进一步将其用于低温加剧高糖致血管损伤的研究。首先,以猪皮明胶（Gel）为原料制备了甲基丙烯酰化明胶（Gel-MA）,将其与N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）以质量比1:1共混为不同浓度的单体溶液。通过对二苯甲酮（BP）处理时长和紫外（UV）引发时长的优化,得到其在PDMS上的最佳接枝条件为单体浓度15%,BP处理时长20 min,紫外引发时长20 min,此时水凝胶涂层厚度为80 μm,均匀性最佳。随后对该水凝胶涂层进行各项理化表征。结构形态方面,通过红外光谱（FTIR）确定了两种单体的成功接枝;并通过扫描电子显微镜（SEM）与能谱仪（EDS）观察了涂层形态与氮元素分布。温敏性能方面,该涂层低临界溶解温度（LCST）为31℃;涂层溶胀率为18.5%,退溶胀率15.9%。力学性能方面,涂层对PDMS基底的机械强度无显著影响,且该涂层具有优异的抗压、抗摩擦性能,能承受高压蒸汽灭菌。细胞相容性方面,人脐静脉内皮细胞（HUVEC）可在该温敏涂层上正常黏附和增殖,且低温下细胞仍能良好黏附,这为血管芯片的应用提供了重要基础。其次,利用该温敏水凝胶涂层,构建了与肢端微血管袢形似的单通道血管芯片。在此基础上,进一步仿生化构建了双通道血管芯片,模拟人体冷应激下肢端血管内的血流再分配过程。该芯片具有较高的构建精度和良好的封接效果,并且能在20 s内完成生理温度和低温间循环相变。通过冷模试验,得出涂层厚度200μm时,目标通道在37℃和4℃间平均流速相差4%;涂层厚度300μm时,目标通道在37℃和4℃间平均流速相差10%;而涂层厚度达到700μm时,目标通道会完全堵塞。其中涂层厚度300μm时的流动特性更接近人体肢端血管受冷刺激后的血流分配变化。进一步利用该芯片探究了低温对HUVEC功能的影响,发现该模型上乳酸脱氢酶（LDH）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、内皮素-1（ET-1）和一氧化氮（NO）等内皮细胞功能表达趋势与体内一致,而静态培养下细胞功能表达不佳。最后,利用双通道温敏血管芯片探究了低温暴露对HUVEC高糖损伤的加剧作用。结果显示,高糖+低温组的血管屏障完整性最差;同时,低温会加速高糖诱导的细胞凋亡,并造成细胞坏死;此外,低温还会进一步抑制胞间钙黏蛋白的表达,引起肌动蛋白大量解聚,细胞形态无法维持;细胞功能方面,低温协同高糖促进了细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）,同时增强了 ET-1和ICAM-1的表达,并抑制NO表达;低温还加剧了活性氧自由基（ROS）堆积,导致线粒体膜电位（MMP）崩溃。上述结果在细胞水平上再现了高血糖患者更容易受到低温损伤的临床现象,并初步阐释了其发生和发展过程。而静态实验组（二维细胞板培养）并未显示低温加剧高糖损伤的作用。综上所述,与静态培养相比,仿生化双通道血管芯片更准确地反映了体内高糖与低温刺激对血管内皮细胞的损伤机制。该芯片有望用于低温暴露致心脑血管疾病的发病机理研究和治疗药物筛选,为该领域提供一种新型体外研究工具。

关键词：温敏水凝胶血管芯片低温高糖血管内皮细胞

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核酸介导微血管网络的形成及其应用研究

核酸介导微血管网络的形成及其应用研究

作者：余紫荆华东师范大学

学位级别：硕士

血管系统在维持体内循环的稳态中发挥着重要作用,包括营养物质和气体的运输、体温的调节和组织间信号分子的运输。为了揭示血管疾病的病理生理机制以及促进对血管系统生化和生理过程的理解,近年来构建了许多模拟血管系统功能的体外血管... 详细信息

血管系统在维持体内循环的稳态中发挥着重要作用,包括营养物质和气体的运输、体温的调节和组织间信号分子的运输。为了揭示血管疾病的病理生理机制以及促进对血管系统生化和生理过程的理解,近年来构建了许多模拟血管系统功能的体外血管模型。在这当中,血管芯片利用天然或合成细胞外基质填充微流控管路为内皮细胞提供了与体内相似的3D环境,并促进内皮细胞的功能性分化形成体外微血管网络。然而,目前常用的天然生物基质容易被污染且操作复杂,批次差异性大,而合成细胞外基质缺乏内源性生物因子不利于促进功能性组织的形成。因此,非常有必要开发一种能够具有生物相容性、易于合成且具有内源性因子的材料用于细胞体外3D培养,从而构建新的体外微血管模型。针对这一问题,本工作提出一种DNA介导微血管网络形成的方法。通过原位聚合,在微管路内部生长出DNA聚合物,为内皮细胞提供生物相容性良好的柔性界面;在DNA聚合物中设计的血管内皮生长因子（VEGF）适配体能够特异性结合VEGF分子,可促进内皮细胞在其表面的功能性分化。这样DNA聚合物功能化的界面可以有效促进内皮细胞的生长及分化,从而诱导微血管网络的形成。此外,通过调节DNA聚合物中VEGF适配体密度,可以实现对微血管网络交联密度的调控。DNA介导微血管网络的形成将为血管芯片的构建提供了有力工具。为了研究早期动脉粥样硬化的生理病理过程,将DNA介导形成的微血管网络与多个电化学生物传感器集成构建了集成式血管芯片系统。采用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）对微血管刺激模拟动脉粥样硬化早期病理状况,并动态监测了微血管中p H,ATP和ROS等多个参数指标。结果ox-LDL引起人脐静脉人皮细胞（HUVEC）线粒体功能障碍。总的来说,这种集成式的芯片系统可以用于疾病模型微生理状态的长期、无损监测,有望加快药物研发和药物筛选。

关键词：血管芯片微血管网络核酸技术微流控技术生物传感

基于微流控技术的生物医用载细胞水凝胶微纤维制备

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基于微流控技术的生物医用载细胞水凝胶微纤维制备

作者：贾娈娈苏州大学

学位级别：硕士

微流控技术是一种通过微通道精确操控微小流体的技术,在DNA测序、蛋白质分离和体外诊断等领域广泛应用,而其用于微球、微纤维等微结构材料制备则是近十几年来新兴的研究领域。水凝胶微纤维因其优异的生物相容性、柔韧性和组装能力在组... 详细信息

微流控技术是一种通过微通道精确操控微小流体的技术,在DNA测序、蛋白质分离和体外诊断等领域广泛应用,而其用于微球、微纤维等微结构材料制备则是近十几年来新兴的研究领域。水凝胶微纤维因其优异的生物相容性、柔韧性和组装能力在组织工程领域备受关注。通过微流控技术制备材料的过程可在温和条件下进行,流体不需暴露于高温、高压、有机溶剂或高应力等苛刻条件下。因此,通过该技术可以制备生物相容性良好的水凝胶微纤维,细胞在这些微纤维中能够更好地存活。近年来,通过微流控技术制备水凝胶微纤维成为研究热点,载细胞微纤维也在组织工程和器官芯片等领域展现出应用价值。为了满足多方面的应用需求,需要制备不同结构的微纤维,为此往往需要设计多种复杂的微流控装置,这限制了微流控技术在更多领域的应用。因此,本论文的第一部分工作介绍了一种简便、灵活的双层流微流控系统,仅通过更换流体在同一微流控装置上制备了单层、双层和中空结构的线形载细胞水凝胶微纤维,它们可以应用于不同工程组织的仿生构建。此外,DNA、螺旋藻和螺旋血管等螺旋结构在自然界中发挥重要作用。然而,目前制备螺旋微纤维的研究非常少,多层、中空等复杂结构螺旋微纤维的制备更加面临挑战。在本论文的第二部分工作中,我们通过微流控技术成功制备了多层、中空和超螺旋等复杂结构的螺旋水凝胶微纤维,并可以通过对装置和流速的调节对螺旋微纤维的尺寸和结构实现精确控制。另外,为了建立体外螺旋血管模型,我们还制备了载细胞螺旋结构微纤维,并探究了其在血管芯片领域的应用。总之,本论文通过微流控技术制备了从简单线形结构到复杂螺旋结构的载细胞水凝胶微纤维,并探究了它们在生物医学领域的潜在应用。

关键词：微流控载细胞微纤维螺旋微纤维组织工程血管芯片