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血管生成素参与激素性股骨头坏死血管损伤的机制研究

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血管生成素参与激素性股骨头坏死血管损伤的机制研究

作者：万里甫安徽医科大学

学位级别：硕士

背景糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是非创伤性股骨头坏死的最常见诱因,随着相关研究的不断深入,我们发现需要使用GC治疗疾病的患者中,大约有5-40%的比例,最终都会发展至股骨头坏死,并且股骨头坏死的发生率随着使用剂量的增加和使用时... 详细信息

背景糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是非创伤性股骨头坏死的最常见诱因,随着相关研究的不断深入,我们发现需要使用GC治疗疾病的患者中,大约有5-40%的比例,最终都会发展至股骨头坏死,并且股骨头坏死的发生率随着使用剂量的增加和使用时间的延长而逐渐增加。股骨头血供减少是激素性股骨头坏死发生(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)的重要机制之一,GC既能够对既存血管造成直接损伤,又能够抑制新生血管的形成。而血管生成素(angiogenin,Ang)几乎参与了血管从新生到成熟的整个过程,且骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stem cell,BMSC)是Ang的重要来源。为此我们设想,糖皮质激素可能通过抑制BMSC来源的血管生成素表达抑制股骨头区域的血管新生,进而减少股骨头血供,诱导股骨头坏死的发生。而靶向干预Ang的表达能够缓解GC造成的血供减少,对SONFH起到一定的治疗作用。本研究旨在研究明确Ang在SONFH中的作用机制并为SONFH的早期诊断和治疗提供一定的依据。目的1)进一步探索激素性股骨头坏死的发生机制2)明确Ang对BMSC及其促血管生成能力的影响3)探索Ang靶向干预对SONFH的治疗作用方法:本研究共分为体内和体外两大部分。体外实验部分的所用GC为长效GC地塞米松(dexamethasone,DEX),所有细胞于37℃,含5%CO2中的细胞培养箱中培养。体内以SD大鼠为实验对象,根据所报道文献,SONFH模型建立方法为:甲强龙(methylprednisolone,MP)20mg/kg/d,每周连续3次臀大肌注射,连续注射3周,6周后取材检测。1)GC干预的BMSC中Ang的表达情况及促血管生成能力变化采用CCK8试剂盒检测BMSC增殖水平,流式细胞仪检测BMSC凋亡水平。western-blot 方法检测 BMSC 中 Ang、Runx2、ALP、aP2、PPAR-γ蛋白表达情况;Elisa方法检测BMSC培养上清中Ang表达情况。qRT-PCR方法检测Ang、Runx2、ALP、aP2、PPAR-γ的mRNA表达水平。取BMSC培养上清,检测干预后BMSC促人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)体外成管能力的变化。2)Ang靶向干预对BMSC促成管能力的变化采用慢病毒转染技术构建稳定过表达Ang的人BMSC细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白;并检测转染BMSC中Ang蛋白和mRNA的表达,进一步确认细胞构建是否成功。取各组上清液培养HUVEC,检测HUVEC的细胞体外成管。3)Ang靶向干预对大鼠SONFH的治疗构建大鼠SONFH模型,模型开始构建2周后向MP+angiogenin组股骨髓腔内注射Ang过表达慢病毒,6周后行血管造影,取股骨头标本,microCT扫描计算骨小梁参数,如骨密度、骨体积、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁间隔等,观察股骨头坏死发生情况。标本脱钙后microCT扫描观察各组大鼠股骨头血运变化,计算各组股骨头内血管体积,HE染色观察各组大鼠骨小梁结构,CD31染色观察血管新生情况。结果:1)GC抑制hBMSC增殖和成骨分化的同时抑制h BMSC中Ang的表达及抑制促成管能力。(1)CCK-8实验结果显示DEX抑制了 h BMSC的增殖,Annexin V-FITC细胞凋亡实验结果提示DEX促进了hBMSC的凋亡;(2)成骨、成脂诱导培养后,染色结果发现DEX明显抑制了hBMSC的成骨分化、促进了hBMSC的成脂分化;(3)qPCR实验结果显示DEX明显抑制了成骨相关基因m RNA的表达水平,促进了成脂相关基因m RNA的表达水平;(4)Western-blot实验结果显示DEX抑制了hBMSC的成骨分化相关蛋白的表达,促进了成脂分化相关蛋白的表达。(5)DEX抑制了hBMSC中Ang的表达,并抑制了体外促成管能力。2)Ang靶向干预促进了hBMSC中蛋白和RNA的表达,促进了hBMSC的体外促成管能力。(1).CCK-8结果显示,DEX可以抑制转染后的细胞增殖活力,但转入目的基因Ang组细胞增殖活力受到DEX抑制的影响减弱。(2)qPCR实验及WB实验均检验了转染效果,Ang靶向干预组(Ang组)的Ang基因及蛋白表达均明显提高。(3)Ang靶向干预后,Ang组促成管能力提升。3)Ang靶向干预对SONF有一定的治疗作用。(1)microCT扫描计算骨小梁各参数,发现MP组股骨头坏死最明显,MP+angiogenin组较MP组明显减轻了股骨头坏死表现;股骨头标本脱钙后micro CT扫描计算各组股骨头内血管体积,发现MP组大鼠股骨头血管体积明显减少。MP+angiogenin组大鼠坏死股骨头血管数量也有减

关键词：血管生成素骨髓间充质干细胞血管内皮细胞激素性股骨头坏死

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血管生成素对细胞核内功能的体外分析体系

生物化学与生物物理学报 2003年第4期35卷 350-354页

作者：李凌云张耀洲郑一凡胡国富许正平浙江大学医学院公共卫生系浙江大学生命科学学院生物化学研究所浙江大学医学院公共卫生系哈佛大学医学院生物化学与生物物理及医学研究中心浙江大学医学院公共卫生系杭州310031 浙江大学生命科学学院生物化学研究所杭州310029杭州310029杭州310031剑桥02139杭州310031

利用人血管内皮细胞的细胞核而建立的体外转录分析体系可灵敏地定量测定血管生成素促进的RNA转录。反应体系中血管内皮细胞核先在缓冲液中与血管生成素混合 ,然后加四种核糖核苷三磷酸混合物启动反应 ,并以 [α 3 2 P]CTP作为示踪剂确... 详细信息

利用人血管内皮细胞的细胞核而建立的体外转录分析体系可灵敏地定量测定血管生成素促进的RNA转录。反应体系中血管内皮细胞核先在缓冲液中与血管生成素混合 ,然后加四种核糖核苷三磷酸混合物启动反应 ,并以 [α 3 2 P]CTP作为示踪剂确定新生RNA的产量。结果显示 ,该体外分析体系的最适反应温度为 30℃ ,最佳反应时间是 30min ,在此反应条件下血管生成素可定量促进RNA转录 ,并存在着剂量效应。研究发现 ,体系中过高浓度的血管生成素降解RNA产物 ,提示细胞具有控制该因子在细胞核内积聚的生物学机制 ,以保证其在细胞内恰当地发挥作用。抑制血管生成素诱导的RNA转录可能可以抑制血管新生 ,因而可能是治疗肿瘤的一个新的分子靶。

关键词：血管新生血管生成素 RNA转录分子靶

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血管生成素在人口腔鳞癌的表达及意义

华西口腔医学杂志 2005年第1期23卷 63-64,68页

作者：武云霞梁萍南欣荣焦艳军孙晓军山西医科大学第一医院口腔科山西太原030001

目的　研究血管生成素(Ang)家族中Ang_1、Ang_2蛋白在口腔鳞癌组织中的表达,并探讨其与口腔鳞癌病理分级的关系。方法　采用免疫组化SABC方法,检测34例口腔鳞癌组织及16例正常口腔黏膜组织中Ang_1和 Ang_2蛋白的表达。结果　Ang_... 详细信息

目的　研究血管生成素(Ang)家族中Ang_1、Ang_2蛋白在口腔鳞癌组织中的表达,并探讨其与口腔鳞癌病理分级的关系。方法　采用免疫组化SABC方法,检测34例口腔鳞癌组织及16例正常口腔黏膜组织中Ang_1和 Ang_2蛋白的表达。结果　Ang_1、Ang_2蛋白在口腔鳞癌细胞均有表达。Ang_1在正常口腔黏膜和口腔鳞癌组织及各级口腔鳞癌中表达,无明显差异(P>0.05);Ang_2在口腔鳞癌组织的表达明显高于正常口腔黏膜(P血管新生的标志之一,可能与口腔鳞癌的血管生成和早期转移有关。

关键词：血管生成素口腔鳞癌免疫组织化学

血管生成素与受体和缺氧诱导因子在胶质瘤血管新生中的意义

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中华病理学杂志 2008年第3期37卷 188-189页

作者：李晓晗王小松韩琤波郑华川杨向红中国医科大学附属盛京医院病理科沈阳110004 中国医科大学附属盛京医院肿瘤治疗科沈阳110004 中国医科大学基础医学院生物化学教研室

胶质瘤是人类最常见的一种颅内原发肿瘤，其发生和恶性进展受多种因素的影响，其中肿瘤内新血管生成是影响其生物学行为的关键因素之一。大量研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）是胶质瘤血管生成最主要的调节因子。血管生成素（angiopo... 详细信息

胶质瘤是人类最常见的一种颅内原发肿瘤，其发生和恶性进展受多种因素的影响，其中肿瘤内新血管生成是影响其生物学行为的关键因素之一。大量研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）是胶质瘤血管生成最主要的调节因子。血管生成素（angiopoietin）是除VEGF外的另一组内皮细胞特异的细胞因子，我们利用原位杂交检测其受体Tie-2mRNA，用免疫组织化学检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管生成素2（Ang-2）的蛋白表达，探讨它们在胶质瘤血管新生中的临床病理意义及作用机制。

关键词：胶质瘤血管生成缺氧诱导因子1α 血管生成素血管新生受体血管内皮生长因子免疫组织化学检测原位杂交检测

血管生成素相互作用蛋白的发现及其在哺乳动物细胞中的验证

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生物化学与生物物理进展 2002年第3期29卷 429-433页

作者：徐东刚马百坤李莉邹民吉彭善云王嘉玺军事医学科学院基础医学研究所北京100850 南京军区总医院全军医学检验中心南京210002 大连医科大学第二附属医院血液科大连116023

通过RT PCR从人外周血白细胞中钓取血管生成素 (angiogenin ,Ang)cDNA ,构建诱饵蛋白载体 pAS 2 1 Ang ,对其自身转录激活活性进行鉴定后 ,通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库 ,获得两个双阳性克隆 .序列分析和同源检索表明所获... 详细信息

通过RT PCR从人外周血白细胞中钓取血管生成素 (angiogenin ,Ang)cDNA ,构建诱饵蛋白载体 pAS 2 1 Ang ,对其自身转录激活活性进行鉴定后 ,通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库 ,获得两个双阳性克隆 .序列分析和同源检索表明所获候选蛋白分别为人上皮细胞素和λ晶体蛋白 .构建Ang及候选蛋白标签融合表达载体并共转染COS 7细胞 ,利用免疫共沉淀和蛋白质印迹方法在哺乳动物细胞中验证了Ang与候选蛋白间的相互作用 .

关键词：血管生成素相互作用蛋白哺乳动物细胞验证酵母双杂交免疫共沉淀肿瘤新生血管生成

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血管生成素与前列腺癌（英文）

中国生物化学与分子生物学报 2015年第12期31卷 1261-1266页

作者： Nil Vanli 胡国富塔夫茨大学医学院塔夫茨医学中心分子肿瘤研究所

血管生成素(angiogenin,ANG)属脊椎动物特异的核糖核酸酶A超家族第5个成员,是一种分泌型核糖核酸酶,在人类前列腺癌高表达.ANG在前列腺癌的上皮细胞和内皮细胞转位入核,通过刺激r RNA生物合成而介导肿瘤血管新生、癌细胞存活及增殖,从... 详细信息

血管生成素(angiogenin,ANG)属脊椎动物特异的核糖核酸酶A超家族第5个成员,是一种分泌型核糖核酸酶,在人类前列腺癌高表达.ANG在前列腺癌的上皮细胞和内皮细胞转位入核,通过刺激r RNA生物合成而介导肿瘤血管新生、癌细胞存活及增殖,从而促进前列腺癌的进程.ANG刺激r RNA合成不仅为前列腺内皮细胞发生癌变所必需,也是前列腺癌细胞不依赖雄激素生长所必需.动物实验证明,各种针对ANG的拮抗剂,包括抑制其核转位、功能和活性的抑制剂均可抑制前列腺癌.现已明确ANG的作用不依赖雄激素,从而为ANG作为去势(即睾丸切除)抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer)的治疗靶标提供了坚实的理论基础.

关键词：血管生成素前列腺癌血管形成细胞增殖 rRNA生物合成去势抵抗

血管生成素-1对猪慢性缺血心肌中功能性新生血管增生的促进作用

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复旦学报（医学版） 2018年第3期45卷 347-353页

作者：李伟 Winston Ng Shim Eugene Kwangwei Sim 上海市胸科医院心脏外科上海200030 徐州市中心医院心脏外科徐州221009 新加坡国立大学医院心胸血管外科新加坡119077

目的对比血管生成素-1(angiopoietin-1,ANG-1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在猪慢性心肌缺血模型中的促血管再生效果。方法利用Ameroid血管压缩环建立26只猪慢性心肌缺血研究模型,4周后分成3组:腺... 详细信息

目的对比血管生成素-1(angiopoietin-1,ANG-1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在猪慢性心肌缺血模型中的促血管再生效果。方法利用Ameroid血管压缩环建立26只猪慢性心肌缺血研究模型,4周后分成3组:腺病毒携带ANG-1组(Ad ANG-1,n=9),腺病毒携带VEGF组完全恢复灌注术后4周仍然保持缺血状态(Ad VEGF,n=10)和空载体对照组(n=7)。分别在腺病毒介导的基因移植4和12周后,利用荧光微球法测定缺血心肌的局部血流量,并同时进行免疫组化检测。结果基因移植后4周,Ad ANG-1组左心室心肌缺血区的灌注量[(3.25±0.16)m Lmin-1g-1]明显高于Ad VEGF组[(1.09±0.13)m Lmin-1g-1]和对照组[(1.20±0.03)m Lmin-1g-1](P血管密度分别为(19.61±1.76)/0.572 mm2心肌组织和(18.17±1.43)/0.572 mm2心肌组织,均明显高于对照组的(13.53±0.92)/0.572 mm2心肌组织(P血管的密度进而提高了局部心肌灌注。结论 VEGF和ANG-1基因转移均可促进血管再生,但只有ANG-1可以促进功能性小血管的再生,从而稳定有效地增加了心肌灌注,并为心功能的改善提供了必要的组织解剖学基础。

关键词：血管再生血管生成素心肌缺血基因治疗

血管生成素在细胞凋亡调节中的作用机制（英文）

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中国生物化学与分子生物学报 2015年第12期31卷 1258-1260页

作者：李淑萍胡国富塔夫茨大学医学院塔夫茨医学中心分子肿瘤研究所

血管生成素(angiogenin,ANG)是一种核糖核酸酶;最近研究证明,作为一种抗凋亡因子,ANG参与各种抗细胞凋亡过程.ANG对内源性及外源性相关信号途径中的重要分子,如Bcl-2抗凋亡蛋白具有调节作用.此外,ANG对内、外部信号途径中的重要环节——... 详细信息

血管生成素(angiogenin,ANG)是一种核糖核酸酶;最近研究证明,作为一种抗凋亡因子,ANG参与各种抗细胞凋亡过程.ANG对内源性及外源性相关信号途径中的重要分子,如Bcl-2抗凋亡蛋白具有调节作用.此外,ANG对内、外部信号途径中的重要环节——p53依赖的凋亡也具有调节作用.

关键词：血管生成素凋亡 Bcl-2 p53

血管生成素在小鼠皮肤中的表达及其对小鼠毛发生长的影响

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临床皮肤科杂志 2011年第11期40卷 653-656页

作者：周乃慧范卫新苏州大学附属第一医院皮肤科江苏苏州215006 南京医科大学第一附属医院皮肤科江苏南京210029

目的:探讨血管生成素在小鼠皮肤中的表达及其对小鼠毛发生长的影响。方法:利用松香-石蜡拔毛法诱导C57BL/6小鼠背部的毛囊同步进入生长期,半定量RT-PCR检测血管生成素mRNA在不同毛囊周期小鼠皮肤中的表达。分离与培养完整的小鼠触须毛囊... 详细信息

目的:探讨血管生成素在小鼠皮肤中的表达及其对小鼠毛发生长的影响。方法:利用松香-石蜡拔毛法诱导C57BL/6小鼠背部的毛囊同步进入生长期,半定量RT-PCR检测血管生成素mRNA在不同毛囊周期小鼠皮肤中的表达。分离与培养完整的小鼠触须毛囊,加入不同浓度的血管生成素(0～200μg/L),培养8 d后测量毛囊的生长长度。与此同时,皮内注射血管生成素或血管生成素真核表达质粒pEGFP-ANG,并设立同时注射抗人血管生成素抗体组、注射空质粒pEGFP-C2组和注射赋形剂的对照组,观察小鼠局部皮肤颜色的改变,并借助苏木精-伊红染色组织切片测量皮肤的厚度和计数生长期Ⅵ毛囊的比例。结果:半定量RT-PCR显示小鼠皮肤中血管生成素mRNA在生长期表达逐渐增加,生长期晚期表达最高,退行期开始减少,至休止期表达最低,其表达模式与毛囊周围的血管形成相一致。12.5～200.0μg厂L血管生成素呈剂量依赖性地促进体外培养的小鼠触须毛囊生长(P血管生成素和血管生成素真核表达质粒对C57BL/6小鼠背部的局部皮肤颜色无明显影响,但能明显增加局部皮肤的厚度(P血管生成素在小鼠皮肤中的表达具有毛囊周期依赖性的特点,血管生成素可能通过促进毛囊周围的血管形成和诱导毛囊进入生长期Ⅵ而促进小鼠毛发的生长。

关键词：血管生成素毛囊 C57BL/6小鼠