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奈比洛尔改善2型糖尿病大鼠血管内皮胰岛素抵抗的作用及机制

奈比洛尔改善2型糖尿病大鼠血管内皮胰岛素抵抗的作用及机制

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作者：李秋萍山西医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题利用Goto-Kakisaki(GK)大鼠和人主动脉内皮细胞(HAEC)胰岛素抵抗(IR)模型,探讨奈比洛尔改善2型糖尿病大鼠血管内皮IR的作用及其机制,为预防糖尿病心血管并发症提供新思路。方法:(一)动物实验:选取8周龄、雄性自发性2型糖尿... 详细信息

目的:本课题利用Goto-Kakisaki(GK)大鼠和人主动脉内皮细胞(HAEC)胰岛素抵抗(IR)模型,探讨奈比洛尔改善2型糖尿病大鼠血管内皮IR的作用及其机制,为预防糖尿病心血管并发症提供新思路。方法:(一)动物实验:选取8周龄、雄性自发性2型糖尿病GK大鼠和对照Wistar大鼠进行实验。实验开始前,检测GK大鼠空腹血糖(FBG),选取FBG≥11.1mmol/L的GK大鼠进行后续实验。实验分为:Wistar组(等量蒸馏水,ig),Wistar+奈比洛尔组(Wistar+Neb,奈比洛尔10 mg/kg/day,ig),GK组(等量蒸馏水,ig),GK+奈比洛尔组(GK+Neb,奈比洛尔10 mg/kg/day,ig)。实验持续4个月。期间每月测各组大鼠FBG;0月和4月,分别测各组大鼠空腹胰岛素(FINS),进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)、腹腔注射胰岛素耐受实验(IPITT),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感性指数(ISI)。实验结束后,麻醉大鼠,颈动脉插管测收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、心率(HR)和平均动脉压(MAP)。腹主动脉采血,测血清一氧化氮(NO)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL)。快速分离大鼠主动脉,分别用于以下实验:(1)离体血管灌流实验观察主动脉对乙酰胆碱(ACh)、胰岛素(INS)、硝普钠(SNP)及L-NAME预孵后主动脉对ACh、INS的反应;(2)液氮速冻,保存于-80℃冰箱,进行Western blot实验,测胰岛素信号通路相关蛋白(IRS-1,p-IRS-1,PI3K,Akt,p-Akt,eNOS,p-eNOS,GLUT4),内质网应激相关蛋白(ATF6,GRP78,CHOP)和JNK1/2、p-JNK1/2蛋白表达。(二)细胞实验:1.建立HAEC IR模型。本实验比较两种造模方式进而筛选适合的血管IR模型:30 mmol/L葡萄糖联合不同浓度棕榈酸钠(SPA,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L)孵育24 h和33.3 mmol/L葡萄糖联合不同浓度胰岛素(INS,10mol/L、10mol/L、10mol/L、10mol/L)孵育48 h。首先,MTT法检测两种造模方式对HAEC细胞活性的影响,确定适宜的造模方式。其次,葡萄糖氧化酶法检测33.3 mmol/L葡萄糖联合不同浓度INS各组细胞培养液葡萄糖含量,计算细胞葡萄糖消耗量,进而确定适宜的INS浓度与33.3 mmol/L葡萄糖联合诱导HAEC IR。2.不同浓度奈比洛尔对HAEC和高糖高胰岛素致HAEC IR细胞活性的影响。奈比洛尔(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)与HAEC和HAEC IR模型分别培养48 h,MTT法测定各组细胞存活率。3.不同浓度奈比洛尔对高糖高胰岛素致HAEC IR葡萄糖消耗量、NO水平影响。实验分为:空白组(Blank,ECM完全培养基,实验结束后胰岛素不刺激),对照组(Control,ECM完全培养基,实验结束后100 nmol/L胰岛素刺激),IR组(33.3 mmol/L HG+10mol/L INS),不同浓度奈比洛尔+IR组(IR组基础上加奈比洛尔0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)。上述各组培养48 h后,无血清培养液饥饿处理12 h,除空白组外,其余各组均用100 nmol/L INS刺激30 min。总NO试剂盒检测上清液NO含量,葡萄糖氧化酶法测培养液葡萄糖含量,计算各组细胞葡萄糖消耗量。4.奈比洛尔对高糖高胰岛素致HAEC IR模型IRS-1/PI3K/Akt/eNOS通路的影响。实验分组如下:空白组,对照组,IR组,奈比洛尔+IR组(IR组基础上加奈比洛尔1μmol/L)。上述各组细胞培养48 h后,无血清培养基饥饿处理12 h,除空白组外,其余各组均用100 nmol/L INS刺激30 min。Western blot检测各组细胞IRS-1、p-IRS-1、PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。5.奈比洛尔对高糖高胰岛素致HAEC IR内质网应激(ERS)的影响。实验分组如下:空白组,对照组,IR组,奈比洛尔+IR组,IR+TUDCA(IR组基础上加TUDCA 500μg/ml,内质网应激抑制剂)组,奈比洛尔+IR+TM(IR组基础上加入奈比洛尔1μmol/L和TM 5μg/ml,内质网应激诱导剂)组,TM(HAEC加入TM 5μg/ml,内质网应激诱导剂)组。上述各组细胞培养48 h后,无血清培养基饥饿处理12 h,除空白组外,其余各组均用100 nmol/L INS刺激30 min。测细胞培养液NO含量,葡萄糖含量,进而计算葡萄糖消耗量。Western blot检测各组细胞ERS相关蛋白(

关键词：奈比洛尔人主动脉内皮细胞血管内皮胰岛素抵抗 IRS-1/PI3K/Akt/eNOS通路内质网应激

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