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血清外泌体介导lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p/TJP1轴调控胃癌细胞顺铂耐药的研究

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中华消化外科杂志 2023年第12期22卷 1467-1475页

作者：韩明阳白军伟聂洁伟李媛媛张超河南省人民医院胃肠外科郑州450003 河南省人民医院生殖医院郑州450003

目的探讨胃癌患者血清外泌体对胃癌细胞AGS顺铂耐药、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法分离胃癌患者血清外泌体,qRT-PCR检测血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达。体外培养正常胃上皮细胞株GES1、胃癌细胞株AGS、... 详细信息

目的探讨胃癌患者血清外泌体对胃癌细胞AGS顺铂耐药、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法分离胃癌患者血清外泌体,qRT-PCR检测血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达。体外培养正常胃上皮细胞株GES1、胃癌细胞株AGS、人胚肾细胞株293T。AGS细胞与外泌体(Exo)孵育,以PBS处理作为对照,随后转染si-NC或si-HOTTIP-3,设为Exo组、PBS组、si-NC+Exo组、si-HOTTIP-3+Exo组。AGS细胞分别转染si-NC、si-HOTTIP-1、si-HOTTIP-2、si-HOTTIP-3、oe-HOTTIP、vector、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic、oe-HOTTIP+mimic NC、miR-138-5p inhibitor、inhibitor NC、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1及miR-138-5p inhibitor+si-NC,设为si-NC组、si-HOTTIP-1组、si-HOTTIP-2组、si-HOTTIP-3组、oe-HOTTIP组、vector组、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组、oe-HOTTIP+mimic NC组、miR-138-5p inhibitor组、inhibitor NC组、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组及miR-138-5p inhibitor+si-NC组。293T细胞转染mimic NC+HOTTIP wt、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt、mimic NC+HOTTIP mut、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut、mimic NC+TJP1 3′UTR wt、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt、mimic NC+TJP1 3′UTR mut、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR mut分别设为mimic NC+HOTTIP wt组、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt组、mimic NC+HOTTIP mut组、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut组、mimic NC+TJP1 3′UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt组、mimic NC+TJP1 3′UTR mut组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR mut组。CCK8实验检测细胞的顺铂敏感性,平板克隆检测细胞克隆形成,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot实验检测外泌体标志蛋白CD63和CD81、TJP1及耐药相关蛋白P-gp、MCL-1的表达,双荧光素酶实验验证lncRNA HOTTIP、miR-138-5p和TJP1之间的靶向关系。观察指标:(1)lncRNA HOTTIP的表达情况。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。(4)miR-138-5p靶向TJP13′非编码区检测情况。(5)抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey′s检验。计数资料以绝对数表示,组间比较采用χ^(2)检验。相关性分析采用Pearson检验。结果(1)lncRNA HOTTIP的表达情况。lncRNA HOTTIP在胃癌患者血清外泌体中的表达高于在健康志愿者血清外泌体中的表达,差异有统计学意义(P血清外泌体呈圆形或卵圆形;Western blot检测结果显示:血清外泌体中存在标志性蛋白CD63和CD81的表达。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。与PBS组比较,Exo组半抑制浓度(IC50)、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-NC+Exo组比较,si-HOTTIP-3+Exo组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与vector组比较,oe-HOTTIP组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与oe-HOTTIP+m

关键词：胃肿瘤血清外泌体 lncRNA HOTTIP miR-138-5p TJP1 顺铂耐药

血清外泌体微小RNA-375-3p在吗啡依赖大鼠中的作用

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中国临床药理学杂志 2023年第11期39卷 1567-1571页

作者：李汉成林泽鑫曾鹏莫志贤肇庆学院食品与制药工程学院广东肇庆526061 肇庆医学高等专科学校药学院广东肇庆526020 南方医科大学中医药学院广东广州510515

目的探讨血清外泌体微小RNA(miR)-375-3p在吗啡诱导大鼠成瘾中的可能作用机制。方法通过剂量递增法诱导吗啡依赖大鼠戒断模型。将20只大鼠随机分为正常组和模型组,模型组连续6 d皮下注射吗啡,剂量依次递增为5、10、20、40、60、80 mg·k... 详细信息

目的探讨血清外泌体微小RNA(miR)-375-3p在吗啡诱导大鼠成瘾中的可能作用机制。方法通过剂量递增法诱导吗啡依赖大鼠戒断模型。将20只大鼠随机分为正常组和模型组,模型组连续6 d皮下注射吗啡,剂量依次递增为5、10、20、40、60、80 mg·kg^(-1),正常组仅注射0.9%NaCl。用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清外泌体miR-375-3p表达水平。通过Target Scan、miRDB和DIANA Tools预测miR-375-3p靶基因。用DAVID数据库对其靶基因进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析。通过STRING软件对其靶基因编码蛋白进行互作分析。通过Cytoscape软件构建miR-375-3p-靶基因-KEGG网络。结果正常组和模型组第1次戒断评分值分别为2.38±1.21和25.11±3.46,第2次分别为2.51±1.09和17.32±2.67;正常组和模型组纳洛酮第1次催促后体质量分别为(213.95±10.90)和(193.43±15.22)g,第2次分别为(217.09±14.49)和(181.23±14.76)g。模型组与正常组比较,2次戒断评分值及体质量差异均有统计学意义(P血清外泌体miR-375-3p相对表达水平分别为5.70±2.33和13.56±5.18。对miR-375-3p的306个潜在靶基因集合分析发现,其分子功能主要富集于神经元的产生、中枢神经系统发育等生物学过程(P<0.05),涉及谷氨酸能突触及多巴胺能突触等多条信号转导通路(P<0.05)。miR-375-3p靶基因编码蛋白之间存在复杂的相互作用,靶基因L型电压依赖钙离子通道α1C(CACNA1C)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ11(GNG11)、谷氨酸受体红藻氨酸离子5(GRIK5)、盘状大同源物3(DLG3)等编码蛋白在互作网络中具有核心地位。结论miR-375-3p可能通过调控中枢神经系统发育等生物过程作用于谷氨酸能突触及多巴胺能突触等信号通路进而调节下游靶蛋白参与吗啡成瘾的发生过程。

关键词：吗啡药物依赖微小RNA-375-3p 血清外泌体生物功能分析

血清外泌体中mi R-642a-3p下调HK1对胰岛素分泌和儿童1型糖尿病进展的影响

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中国免疫学杂志 2023年第1期39卷 144-151页

作者：边青霞牛春华任志刚胜利油田中心医院内分泌科东营257034

目的:探讨血清外泌体中miR-642a-3p靶向HK1对1型糖尿病(T1DM)患儿胰岛β细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响。方法:GEO数据库筛选T1DM患儿血清中的差异表达miRNAs,Targetscan预测miRNAs的靶基因,双荧光素酶报告实验验证靶向关系。收集68... 详细信息

目的:探讨血清外泌体中miR-642a-3p靶向HK1对1型糖尿病(T1DM)患儿胰岛β细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响。方法:GEO数据库筛选T1DM患儿血清中的差异表达miRNAs,Targetscan预测miRNAs的靶基因,双荧光素酶报告实验验证靶向关系。收集68例T1DM患儿外周血标本,分离并鉴定血清外泌体。高糖培养基处理胰岛β细胞。将转染后的外泌体与胰岛β细胞共培养并分组。采用qRT-PCR分别检测miR-642a-3p在外周血、血清外泌体中的表达水平。流式细胞术、CCK-8试验检测胰岛β细胞的凋亡和增殖情况。ELISA检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰岛素分泌浓度。结果:相对于健康志愿者,T1DM患儿血清及血清外泌体中miR-642a-3p表达明显升高(均P血清外泌体中miR-642a-3p的表达后胰岛β细胞凋亡率降低,增殖活性增加,胰岛素分泌增多,GLP-1浓度上调(均P血清外泌体源性miR-642a-3p能够通过调控HK1抑制胰岛β细胞增殖,并促进其凋亡,从而促进儿童T1DM进展。血清外泌体源性miR-642a-3p有望在儿童T1DM的靶向治疗中发挥作用。

关键词： miR-642a-3p 1型糖尿病血清外泌体胰岛β细胞

血清外泌体微小RNA-338在食管癌中的表达及临床意义

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中华实验外科杂志 2022年第2期39卷 362-365页

作者：王敏刘雪娜刘公哲李大宏山东第一医科大学附属济南人民医院检验科 271199 山东第一医科大学附属济南人民医院心胸外科 271199

目的观察血清外泌体微小RNA-377(miR-377)在食管癌(EC)中的表达水平,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OE33、Eca9706细胞株、5例EC癌组织中miR-377表达水平。选取2016年4月至2019年3月经山东第一医科... 详细信息

目的观察血清外泌体微小RNA-377(miR-377)在食管癌(EC)中的表达水平,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OE33、Eca9706细胞株、5例EC癌组织中miR-377表达水平。选取2016年4月至2019年3月经山东第一医科大学附属济南人民医院确诊并住院治疗的EC患者40例作为观察组,另选取同期本院体检健康者40例作为对照组,RT-qPCR检测血清外泌体中miR-377表达水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清血管内皮生长因子(VEGF)水平;采用χ^(2)检验分析EC患者血清外泌体中miR-377、血清VEGF水平与临床病理特征的关系;Pearson法分析EC患者血清外泌体中miR-377、血清VEGF表达相关性;受试者工作特征(ROC)曲线预测miR-377、VEGF表达水平对EC的诊断价值。结果与正常食管上皮细胞株HEEC细胞中miR-377表达水平(1.07±0.20)比较,OE33、Eca9706癌细胞中miR-377表达水平(0.74±0.21和0.68±0.19)显著降低(F=6.604,P血清外泌体中miR-377表达水平(0.76±0.22)明显低于对照组血清外泌体中miR-377表达水平(1.04±0.25,t=5.318,P血清VEGF表达水平[(22.79±4.79)pg/ml]明显高于对照组血清VEGF表达水平(16.71±3.44)pg/ml,t=6.521,P血清外泌体中miR-377及血清VEGF表达水平与TNM分期、分化程度和淋巴结转移均有关(miR-377:χ^(2)=6.172、8.780、13.864,P血清外泌体中miR-377与血清VEGF表达呈负相关(r=-0.641,P血清外泌体中miR-377诊断EC的ROC曲线下面积为0.835(95%CI:0.684~0.933),灵敏度为69.50%,特异性为88.20%;血清VEGF诊断EC的ROC曲线下面积为0.909(95%CI:0.775~0.977),灵敏度为89.65%,特异性为76.50%;miR-377联合VEGF诊断EC的ROC曲线下面积为0.949(95%CI:0.829~0.994),灵敏度为95.70%,特异性为88.21%。

关键词：食管癌血清外泌体微小RNA-377 诊断价值

血清外泌体及其miRNAs与人体内锰负荷的相关性研究

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血清外泌体及其miRNAs与人体内锰负荷的相关性研究

作者：许鹏飞郑州大学

学位级别：硕士

目的职业性长期接触锰(manganese,Mn)可对神经系统等产生毒性作用,但目前尚无特异性的生物标志物,仅有红细胞锰含量是较认可的反映机体锰负荷的指标。近期有研究提示,外泌体及其miRNA在锰所致的神经损伤中发挥着重要作用,但其是否与机... 详细信息

目的职业性长期接触锰(manganese,Mn)可对神经系统等产生毒性作用,但目前尚无特异性的生物标志物,仅有红细胞锰含量是较认可的反映机体锰负荷的指标。近期有研究提示,外泌体及其miRNA在锰所致的神经损伤中发挥着重要作用,但其是否与机体锰负荷具有相关性及剂量-反应关系,尚未见报道。因此,选取锰暴露人员作为研究对象,检测血清外泌体含量及其miRNAs表达水平与红细胞锰含量,分析其关联性及影响因素,为探寻机体锰暴露相关效应标志物提供新的思路与参考依据。研究对象与方法1.研究对象本研究以河南某客车制造工厂和某铁道货物运输公司423名男性职工为研究对象,年龄为22～54岁,涉及工种包括焊接工(204名)、货运司机及乘务员(219名)。经知情同意后采集研究对象外周血并进行体格检查。通过问卷调查,获取研究对象的一般信息。2.研究方法通过PubMed数据库检索进行筛选,将与锰毒性密切相关的7种miRNAs(miR-125b-5p、miR-16-5p、miR-7-5p、miR-138-5p、miR-4306、miR-210-5p、miR-222-3p)纳入研究。提取研究对象外周血红细胞后,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测红细胞锰含量。根据红细胞锰含量是否超过中位数水平,将研究对象分为低锰组(MnL,n=211)和高锰组(MnH,n=212);采用8%PEG+5%PEG法提取血清外泌体并鉴定,进一步通过实时荧光定量PCR方法检测血清外泌体中7种miRNAs的表达水平。3.统计学分析采用SPSS 21.0和R 4.0.3软件进行统计分析。7种miRNAs表达量的原始数据呈非正态分布,经数据转换后呈正态分布或近似正态分布进行后续分析。定量资料比较使用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。定性资料使用χ2检验。采用协方差分析年龄、吸烟、饮酒、BMI对血清外泌体蛋白浓度及其miRNAs表达量的影响。采用多重线性回归和限制性立方样条分析职业人群体内锰负荷与血清外泌体蛋白浓度及其miRNAs表达量之间的剂量-反应关系。采用多重线性回归分析研究对象年龄、吸烟、饮酒、BMI与体内锰负荷交互作用对血清外泌体蛋白浓度及其miRNAs表达量的影响。检验水准为α=0.05。结果1.职业人群血清外泌体蛋白浓度及其miRNAs表达量的影响因素低锰组和高锰组两组间比较结果显示,高锰组中血清外泌体蛋白浓度、miR-125b-5p、miR-16-5p、miR-7-5p、miR-138-5p的表达水平均高于低锰组(P均33岁)血清外泌体蛋白浓度(7.35±1.74 mg/mL)高于低年龄人群(≤3岁)(6.68±1.77 mg/mL),饮酒人群(8.10±2.14mg/mL)高于不饮酒人群(6.86±1.67mg/mL),差异有统计学意义(F=5.185,P=0.024;F=5.112,P=0.025)。高锰组中不吸烟人群(8.20±1.95 mg/mL)的血清外泌体蛋白浓度高于吸烟人群(7.49±1.72 mg/mL),差异有统计学意义(F=8.399,P=0.004)。低锰组和高锰组的血清外泌体蛋白浓度均随BMI等级升高而有逐渐增加的趋势,且在低锰组中有显著统计学意义(F=9.903,P血清外泌体蛋白浓度及miRNAs表达量与体内锰负荷的剂量-反应关系红细胞锰含量四分位分组后,趋势性检验发现,血清外泌体蛋白浓度、miR-125b-5p,miR-16-5p,miR-7-5p,miR-138-5p、miR-4306 的表达量均随红细胞锰含量升高有递增的趋势(Pfortrend均血清外泌体蛋白浓度、miR-125b-5p,miR-16-5p,miR-7-5p,miR-138-5p的表达量之间存在明显的非线性趋势(P overall均<0.001,Pnon-linearity均<0.05)。利用R语言segmented函数进行分段回归计算出阈值点(cutoff 值),分别为 10.118 μg/1010RBCs、13.331 μg/1010RBCs、4.54 μg/1010 RBCs、3.995 μg/1010 RBCs、11.3 μg/1010 RBCs。

关键词：锰负荷血清外泌体 microRNA 红细胞剂量-反应关系

血清外泌体miRNA-27a-3p表达与PCOS患者的相关性分析

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血清外泌体miRNA-27a-3p表达与PCOS患者的相关性分析

作者：周宁大理大学

学位级别：硕士

目的本研究经由测定多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)病人和正常对照组血清外泌体内micro RNA-27a-3p(miR-27a-3p)的表达差异,进一步分析血清外泌体中miR-27a-3p表达与PCOS患者的相关性,有助于提高我们深入研究PCOS的发... 详细信息

目的本研究经由测定多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)病人和正常对照组血清外泌体内micro RNA-27a-3p(miR-27a-3p)的表达差异,进一步分析血清外泌体中miR-27a-3p表达与PCOS患者的相关性,有助于提高我们深入研究PCOS的发病机理和临床诊断治疗,为发现PCOS诊断标志物和治疗靶点提供新的研究思路。方法选取2020年1月～12月在云南省大理大学第一附属医院生殖医学科门诊患者作为研究对象,收集按纳入与排除标准的30例PCOS患者作为实验组,同时将所收集的同期15位卵巢功能无异常病人归入对照组。记录患者的年龄、体重指数(body mass index,BMI)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estrogen,E2)、胰岛素(insulin,INS)、血糖(glucose,Glu)、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulin resistance,HOMA-IR)。利用外泌体提取试剂盒对血清中的外泌体进行提取,透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察所提取的外泌体的外观及形态,随后采取蛋白免疫印迹实验(Western-blot,WB)鉴定膜特异性蛋白CD9、CD63的表达,然后借助实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)法对两组入组对象的血清外泌体内miR-27a-3p的表达水平展开测定,对血清外泌体内miR-27a-3p表达和PCOS病人之间的关联性展开分析。经由分析受试人员工作特征曲线ROC及曲线下面积AUC来评价血清外泌体miR-27a-3p对PCOS诊断的特异性及敏感性。结果对于临床基本资料开展统计分析的结果显示,对比PCOS组入组对象和对照组对象,在年龄、FSH值以及E2值方面,皆为P>0.05,即皆未见明显区别,在BMI、LH、T、Glu、INS这些方面,对比两组的结果皆为P血清外泌体内miR-27a-3p的相对表达水平为明显上调表现(P血清内的提取物与文献中对外泌体特征与形态的描述相符。2.PCOS患者体重指数、LH值、Glu值、胰岛素的水平均明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P血清外泌体内为明显高表达表现(P血清外泌体内miR-27a-3p的表达水平与LH、T、HOMA-IR水平均有相关性,表现出显著联系(P血清外泌体内miR-27a-3p在对PCOS进行诊断方面具备一定应用价值。

关键词： miRNA-27a-3p 多囊卵巢综合征血清外泌体

血清外泌体miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484作为卵巢癌诊断的生物标志物研究

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血清外泌体miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484作为卵巢癌诊断的生...

作者：冯坤西南医科大学

学位级别：硕士

目的:卵巢癌作为妇科的三大恶性肿瘤之一,发病常常较为隐匿,早期卵巢癌缺乏特异性症状、体征及辅助检查,卵巢癌一经发现往往已是中晚期。早期卵巢癌预后相对较好,晚期卵巢癌复发率及死亡率极高,预后极差。目前通过手术、药物化疗、靶向... 详细信息

目的:卵巢癌作为妇科的三大恶性肿瘤之一,发病常常较为隐匿,早期卵巢癌缺乏特异性症状、体征及辅助检查,卵巢癌一经发现往往已是中晚期。早期卵巢癌预后相对较好,晚期卵巢癌复发率及死亡率极高,预后极差。目前通过手术、药物化疗、靶向药物治疗等治疗手段,早期卵巢癌5年生存率可达到60%以上,而晚期卵巢癌患者5年生存率仅约30%,故如何通过检测发现早期卵巢癌在卵巢癌的诊断治疗中尤为重要。目前常规筛查卵巢癌方法主要有肿瘤标志物(如CA125、人附睾蛋白4(HE4)等)联合影像学方法等,但敏感性及特异性较低。外泌体属于细胞外囊泡的一种,有脂质、RNA、蛋白质等多种成分,参与细胞间通讯、机体免疫及能量代谢等多种生理病理过程。近来研究发现外泌体是肿瘤微环境中的重要组成成分,其在肿瘤的生长转移、侵袭及肿瘤的化疗耐药等过程中发挥着重要作用。外泌体主要由核糖核酸、转录因子、蛋白质、以及脂质等组成,在各种体液中普遍存在。其中miRNA是非编码RNA,能在转录之后,对m RNA加以修饰,从而起到调节基因表达的作用,miRNA在体内循环中较为稳定,而且能通过多种体液(如:血浆和血清等)等检测出来,外泌体中的miRNA因有外泌体的保护能减少降解酶的反应,故较体液中更加稳定。miRNA可参与多个生物学进程,如:形成癌症干细胞、以及增殖和转移细胞等,还能在生成肿瘤血管和调节细胞外基质的表达中起到非常重要的作用,本研究旨在通过分析卵巢癌患者外泌体miRNA表达水平,找出可作为卵巢癌早期诊断的生物标志物并加以验证。方法:收集绵阳市中心医院2021年3月至2022年11月的卵巢癌患者20例,同期收集卵巢良性肿瘤患者20例、于绵阳市中心医院体检的健康人20例作为对照组,标本收集由本课题组成员共同完成。每组各例分别采取外周静脉血10ml,采血时需保证患者系清晨空腹状态,采血后立即采用超速离心法提取外泌体,并对提取的外泌体进行电镜、粒径分析、蛋白提取浓度测定以及WB蛋白指标检测。然后利用Trizol法从血清外泌体中提取miRNA,用二代测序技术对血清外泌体miRNA进行测序,筛选差异表达的miRNA。其次,采用实时荧光定量PCR法检测血清外泌体miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484基因的表达水平,最后通过灵敏度、特异度、AUC分析对应基因可能作为卵巢癌诊治生物标志物的价值。结果:成功从血清中提取出外泌体并鉴定,从血清外泌体中成功提取miRNA并进行测序,通过二代测序方法找到卵巢癌患者外泌体中差异性低表达的miRNA。分析差异miRNA表达情况并查阅相关文献选取具有代表意义的miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484提取后进行浓度检测,证实miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484均在血清外泌体中稳定存在,然后通过实验对比卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者及正常人群中血清外泌体中miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484表达情况以验证血清中外泌体miR-335-5p、miR-122-5p、miR-484在卵巢癌诊断中的价值。q RT-PCR检测结果表明卵巢癌患者血清外泌体中miR-335-5p基因在卵巢癌组vs卵巢良性肿瘤组,卵巢癌组vs对照组和卵巢良性肿瘤组vs对照组的比较中,差异均具有统计学意义。miR-122-5p基因在卵巢癌组vs卵巢良性肿瘤组和卵巢癌组vs对照组相比差异均具有统计学意义,而卵巢良性肿瘤组与对照组相比差异无统计学意义。miR-484在三组间差异无统计学意义,同时组内两两比较差异也无统计学意义。结论:血清外泌体中miR-335-5p和miR-122-5p可作为早期卵巢癌的诊断标志物。血清外泌体中miR-335-5p对卵巢良恶性肿瘤鉴别有一定诊断价值。miR-335-5p、miR-122-5p联合HE4对诊断卵巢肿瘤的良恶性优于单个指标。

关键词：卵巢癌血清外泌体 miRNA 生物标志物

血清外泌体通过LOX-1/TRAF6/NF-κB信号通路调控高糖干预下破骨细胞骨吸收功能

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血清外泌体通过LOX-1/TRAF6/NF-κB信号通路调控高糖干预下破骨细...

作者：司惠玲甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究主要探讨高糖状态下血清外泌体通过凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)/肿瘤坏死相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)/核因子κB(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,NF-κB)信号途径调控破骨细胞骨吸收功能及相关因子变化的分子机制,旨在阐明糖尿病性骨质疏松(Diabetic osteoporosis,DOP)的病理机制及为寻找治疗糖尿病性骨质疏松的靶向药物提供新思路。方法:体外从C57BL/6小鼠中分离提取骨髓巨噬细胞,诱导分化成破骨细胞,进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定,用DMEM高糖培养基培养破骨细胞;采用Exo Quick 外泌体提取试剂盒,从健康人体的血清中提取外泌体,用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)进行形态学特征观察和纳米颗粒追踪分析技术(Nanosight,NTA)进行颗粒浓度分布分析,并用新鲜提取的血清外泌体干预破骨细胞;构建慢病毒LOX-1沉默载体(lentiviral silencing vector,LV-LOX-1)和慢病毒空载体(lentiviral control vector,LV-CON)对破骨细胞进行转染;实验分组为:对照组(NC组)、高糖组(HG组)、慢病毒LOX-1沉默组(LV-LOX-1组)和慢病毒空载体组(LV-CON组);分别使用TRAF-STOP 6877002(TRAF6抑制剂)和BAY11-7082(NF-κB抑制剂)处理破骨细胞,采用CCK-8法检测破骨细胞活力。采用qRT-PCR和Western blotting技术检测破骨细胞中LOX-1、TRAF6、NF-κB、基质金属酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9),抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)的mRNA和蛋白的表达水平。结果:1.TRAP染色结果显示:在倒置相差显微镜下可观察到破骨细胞体积较大,形态多样,边缘有褶皱,周围可见血清外泌体大量伪足,大多数破骨细胞被染成强蓝色斑点并可见≥3个细胞核。2.TEM结果显示:大部分血清外泌体颗粒呈圆形囊泡状,直径约为100 nm。3.NTA结果显示:提取出的血清外泌体颗粒直径大多在30～150 nm之间,其中74.75nm分布最多,浓度为3.34E+9粒/ml。4.HG组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平增加。与NC组相比,HG组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP中mRNA表达水平分别增加了134.46%、100.60%和136.36%,蛋白表达水平分别增加了49.47%、59.35%和44.18%,差异具有统计学意义(P<0.01)。5.HG+LV-LOX-1组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平降低,与HG+LV-CON组相比,HG+LV-LOX-1组细胞LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了27.47%、25.62%和29.40%,蛋白表达水平分别降低了19.10%、23.78%和23.56%,差异具有统计学意义(P<0.01)。6.EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白的表达水平降低,与NC组相比,NC+EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了45.14%、47.18%、46.11%,蛋白表达水平分别降低了40.98%、49.25%、43.31%,差异具有统计学意义(P<0.01);与HG组相比,HG+EXOs组细胞中LOX-1、MMP-9和TRAP的mRNA表达水平分别降低了53.61%、54.63%、60.37%,蛋白表达水平分别降低了49.19%、50.37%、72.52%,差异具有统计学意义(P<0.01);7.HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP 6877002组和HG+LV-LOX-1+BAY11-7082组细胞中TRAF6、NF-κB、MMP-9和TRAP的mRNA和蛋白表达水平降低。与HG+LV-LOX-1组相比,HG+LV-LOX-1+TRAF-STOP 6877002组细胞中TRAF6、NF-κB、MMP-9和TRAP,mRNA表达水平分别降低了55.79%、38.46%、37.27%,40.69%,蛋白表达水平分别降低了36.89%、19.92%、38.74%、32.38%,差异具有统计学意义(P<0.01)。与HG+LV-LOX-1组相比,HG+LV-LOX-1

关键词： LOX-1 糖尿病性骨质疏松破骨细胞血清外泌体骨吸收

急性期川崎病患儿血清外泌体蛋白质组学的前瞻性研究

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中国当代儿科杂志 2022年第4期24卷 392-398页

作者：张帆张欠文王娜娜刘倩沈洁侯淼孙凌吕海涛严文华黄洁苏州大学附属儿童医院心内科江苏苏州215003 苏州大学附属儿童医院呼吸科江苏苏州215003

目的筛选急性期川崎病(Kawasaki disease,KD)患儿血清外泌体蛋白,分析其生物学过程及功能,以期为早期临床诊断KD提供新的生物标志物。方法前瞻性选取2019年6月至2020年8月于苏州大学附属儿童医院治疗的KD患儿(n=13)纳入KD组;同期选取... 详细信息

目的筛选急性期川崎病(Kawasaki disease,KD)患儿血清外泌体蛋白,分析其生物学过程及功能,以期为早期临床诊断KD提供新的生物标志物。方法前瞻性选取2019年6月至2020年8月于苏州大学附属儿童医院治疗的KD患儿(n=13)纳入KD组;同期选取因细菌感染入该院治疗的患儿(n=13)纳入感染对照组。采集两组患儿入院次日清晨空腹全血,离心后获得血清标本,超高速离心提取外泌体,采用非标记定量蛋白质组学技术对血清外泌体蛋白进行分析,筛选差异蛋白并进行功能富集分析,绘制蛋白质互作网络图像,通过靶向蛋白组学技术验证特有蛋白。结果两组共筛选出131种差异蛋白,其中27种蛋白为两组共有。48种蛋白为KD组特有,其中上调蛋白23种,下调蛋白25种。这些蛋白作用于补体和凝血级联、MAPK信号通路。靶向蛋白质组学技术验证显示,KD组中FGG、SERPING1、C1R、C1QA、IGHG4、C1QC蛋白可定量。29种蛋白仅在感染对照组中表达,其中上调蛋白12种,下调蛋白17种。感染对照组中通过靶向蛋白质组学技术验证可定量4种蛋白,分别为VWF、ECM1、F13A1、TTR。两组分别绘制蛋白质互作网络图像,KD组中FGG及C1QC与其他蛋白互作关系紧密;感染对照组中VWF与其他蛋白互作关系紧密。结论急性期KD患儿血清外泌体蛋白FGG及C1QC有望作为早期诊断KD的新的生物标志物。对于不明原因发热的患儿,检测蛋白FGG、C1QC及VWF可能有助于病因筛查。

关键词：川崎病血清外泌体蛋白质组学生物标志物儿童