检索结果-南通市图书馆

作者：汤春雨大连海洋大学

学位级别：硕士

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是一种在炎症反应、细胞凋亡等多种生理过程中发挥重要作用的细胞因子,其表达会受到转录因子脂多糖诱导的TNF-α因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-αfactor,LITAF)的调节。作为典型的信号... 详细信息

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是一种在炎症反应、细胞凋亡等多种生理过程中发挥重要作用的细胞因子,其表达会受到转录因子脂多糖诱导的TNF-α因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-αfactor,LITAF)的调节。作为典型的信号传导因子,TNF能通过肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)激活下游的信号通路。近年来的研究发现,在软体动物中存在LITAF、TNF-α和TNFR的同源物,但其的免疫调控作用和机制尚不明确。本研究采用生物学技术与方法,从长牡蛎(Crassostrea gigas)中鉴定LITAF、TNF-α和TNFR同源物(命名为CgLITAF、CgTNF3/4和CgTNFR),分析了它们的结构和功能特征,阐明了它们在调节长牡蛎血淋巴细胞凋亡中的作用机制。主要研究结果如下:1.长牡蛎CgLITAF、CgTNFs和CgTNFR的分子结构及表达特征长牡蛎CgLITAF含有一个保守的LITAF结构域和两个CXXC基序;长牡蛎CgTNF3和CgTNF4都含有一个保守的TNF结构域,它们的启动子区都含有两个CTCCC基序,该基序能与CgLITAF的两个CXXC基序结合;长牡蛎CgTNFR含有一个保守的TNFR结构域和一个DEATH结构域。CgLITAF主要在肝胰腺、神经节、血淋巴细胞中显著高表达,CgTNFs和CgTNFR分别在鳃和血淋巴细胞中显著高表达。2.长牡蛎CgLITAF、CgTNFs和CgTNFR的免疫应答方式CgLITAF的mRNA表达水平在LPS刺激0-48 h后未见显著变化,而在72 h后显著高于对照组,同时LPS刺激引起血淋巴细胞中CgLITAF蛋白明显的细胞核移位。在LPS或灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激3 h、6 h和12 h后,血淋巴细胞中CgTNF3、CgTNF4和CgTNFR的mRNA表达水平均显著升高。体外抑菌实验显示CgTNF3和CgTNF4分别与不同浓度的***共孵育后,皆具有抑制***生长的活性,呈浓度依赖的特征。3.长牡蛎CgLITAF、CgTNFs和CgTNFR介导血淋巴细胞凋亡的分子机制利用si RNA干扰CgLITAF表达后,血淋巴细胞中CgTNF3和CgTNF4的mRNA表达量显著下降;获得原核表达的CgLITAF、CgTNF3/4和CgTNFR重组蛋白并制备获得CgLITAF的多克隆抗体。通过生物膜干涉技术检测发现r CgTNFR与r CgTNF3和r CgTNF4蛋白均存在相互作用。利用RNAi技术分别干扰CgLITAF和CgTNFR的表达后,长牡蛎血淋巴细胞的凋亡水平均显著下降,同时,血淋巴细胞中促凋亡相关因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinases,CgCaspase8,CgCaspase7,CgCaspase3,CgCaspase9)、细胞色素c(CgCytochrome c)和B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma/leukemia,Bcl-2)家族成员(Bcl2-associated X protein,CgBax)的mRNA表达量也显著下降,抑凋亡相关因子(CgBcl)的mRNA表达量显著上升。长牡蛎中干扰素相关因子类干扰素蛋白(Interferon-like protein,CgIFNLP)、信号转导和转录激活子(Signal Transducers and Activators of Transcription,CgSTAT)、黏病毒抵抗蛋白(Myxovirusresistance,CgMx)、干扰素诱导蛋白44-like(Interferon-induced protein 44-like,CgIFI44L)和长牡蛎病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein,CgViperin)的mRNA表达量也显著下降。说明CgLITAF、CgTNFs和CgTNFR之间存在相互作用机制,能共同调控长牡蛎血淋巴细胞的凋亡。综上所述,从长牡蛎中鉴定到了结构保守的CgLITAF、CgTNF3/4和CgTNFR,它们在各个组织中均有表达,也能响应免疫刺激;且当LPS刺激后,CgLITAF能通过转位入核介导血淋巴细胞中CgTNF3和CgTNF4表达。CgTNFs与CgTNFR结合后会诱导血淋巴细胞凋亡。研究结果有助于揭示长牡蛎TNF介导细胞凋亡在抗细菌免疫应答过程中的作用,也有助于更深入的了解海洋无脊椎动物TNF及其相关分子的免疫调节机制。

关键词：长牡蛎 CgLITAF CgTNFR CgTNF 血淋巴细胞凋亡

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低氧胁迫下中华绒螯蟹血淋巴细胞的转录组学

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水产学报 2023年第4期47卷 27-41页

作者：候利波陆银月任秋霖孔祥会朱雷顾伟孟庆国河南师范大学水产学院南京师范大学海洋科学与工程学院江苏省水生甲壳动物病害重点实验室

为了探究低氧胁迫对中华绒螯蟹血淋巴细胞影响的分子机制，实验通过使用Nova Seq 6 000测序技术，检测了低氧组(1.5±0.5) mg/L和对照组(6.0±0.5) mg/L分别处理24 h后的中华绒螯蟹血淋巴细胞的转录组数据变化。首先，对测序得到的原始... 详细信息

为了探究低氧胁迫对中华绒螯蟹血淋巴细胞影响的分子机制，实验通过使用Nova Seq 6 000测序技术，检测了低氧组(1.5±0.5) mg/L和对照组(6.0±0.5) mg/L分别处理24 h后的中华绒螯蟹血淋巴细胞的转录组数据变化。首先，对测序得到的原始数据进行拼接、注释以及筛选，分析获得的128 614个转录本和128 614条基因，平均长度为2 634 bp (N50),Q30> 92%。其次，以1.2倍为阈值，共筛选出1 687个差异表达基因，其中上调基因899个，下调基因788个。GO和KEGG分析发现，低氧胁迫对中华绒螯蟹血细胞的三羧酸循环、糖酵解途径、ECM-受体相互作用、间隙连接、细胞凋亡、酚氧化酶系统以及其他免疫相关基因等产生了显著影响。最后，随机挑选转录组数据中的10个基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证，结果显示与转录组数据分析相一致，其中包括6个上调的基因：整合素1、铜/锌超氧化物歧化酶、磷酸肌醇3激酶、磷酸甘油酸突变酶2、PDGF/VEGF相关因子1和relish;4个下调的基因：无脊椎连接蛋白7、热休克蛋白90、线粒体ATP合成酶α和天冬氨酸转氨酶。本研究初步阐明了中华绒螯蟹血淋巴细胞短时间内应对低氧胁迫的分子机制，同时该结果也可为今后研究其他甲壳动物在应对低氧胁迫时的生理机制和分子机制提供参考。

关键词：中华绒螯蟹血淋巴细胞低氧胁迫转录组分析

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乳酸介导低氧诱导因子（EsHIF-1α）对中华绒螯蟹血淋巴细胞响应低氧胁迫的调控作用研究

乳酸介导低氧诱导因子（EsHIF-1α）对中华绒螯蟹血淋巴细胞响应...

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作者：王凤池大连海洋大学

学位级别：硕士

中华绒螯蟹味道鲜美且营养丰富,具有重要的经济价值,是我国重要的甲壳类养殖品种之一。在中华绒螯蟹的养殖及商品化运输过程中,水体环境变化、高密度养殖和长途运输经常使其处于低氧胁迫环境中。为初步解析中华绒螯蟹适应低氧胁迫的作... 详细信息

中华绒螯蟹味道鲜美且营养丰富,具有重要的经济价值,是我国重要的甲壳类养殖品种之一。在中华绒螯蟹的养殖及商品化运输过程中,水体环境变化、高密度养殖和长途运输经常使其处于低氧胁迫环境中。为初步解析中华绒螯蟹适应低氧胁迫的作用机制,本研究锚定低氧诱导因子Es HIF-1α,探究了其参与调控中华绒螯蟹血淋巴细胞响应低氧胁迫的作用模式,分析了Es HIF-1α及乳酸在血淋巴细胞适应低氧胁迫过程中发挥的功能,并揭示了低氧胁迫下血淋巴细胞比例发生变化的原因,同时明确了乳酸刺激和血淋巴细胞功能的内在联系,初步勾勒了Es HIF-1α及乳酸调节参与中华绒螯蟹血淋巴细胞功能以应对低氧应激的调控网络。主要研究结果和结论如下:1.中华绒螯蟹低氧诱导因子Es HIF-1α的开放阅读框架长度为3174bp,编码的氨基酸序列为1057aa。序列比对、结构域预测与系统发育进化树分析表明Es HIF-1α属于高度保守序列,其含有HLH、PAS和PAC结构域,其在进化树上的地位与青蟹、凡纳滨对虾相近,属于十足目甲壳动物。在低氧胁迫3h后中华绒螯蟹血淋巴细胞中Es HIF-1α基因蛋白质水平显著上调,到12h时表达量最高,为常氧条件下的9.5倍(p细胞术结果表明低氧胁迫下血淋巴细胞的分型也发生了显著变化,透明细胞占比显著增加,并在24h后达到最高(为常氧组透明细胞占比的6.0倍,p细胞占比在低氧胁迫下显著下降,在24h后达到最低(为常氧组颗粒细胞占比的0.2倍,p血淋巴细胞中参与能量代谢和细胞周期相关基因的表达量不尽相同,其中在透明细胞中Es HIF-1α表达量最高,而在颗粒细胞和透明细胞中,细胞周期调节基因和能量代谢基因如Es GLUT、Es AMPK等则表达量较高,由此推测半颗粒细胞可能是中华绒螯蟹血淋巴细胞中最活跃的细胞,而透明细胞则属于未成熟的前体血淋巴细胞。注射IOX4(Es HIF-1α激活剂)能够显著提升血淋巴中透明细胞的占比并降低了颗粒细胞的占比,而注射KC7F2(Es HIF-1α抑制剂)则明显抑制了低氧胁迫下血淋巴细胞中透明细胞占比增加和颗粒细胞占比减少的趋势。激活Es HIF-1α的同时激活了血淋巴细胞中血蓝蛋白基因的表达,由此推测Es HIF-1α通过调节血淋巴细胞比例和增加血淋巴细胞血蓝蛋白的合成从而增强中华绒螯蟹对低氧胁迫的适应。3.血淋巴内乳酸水平的增加能够显著影响血淋巴细胞内相关基因如Es HIF-1α、Es GLUT、Es Caspase等基因的表达,同时也对血淋巴细胞分型产生影响,而注射(R)-GNE-140(LDH抑制剂)后血淋巴细胞基因的表达则呈现相反的趋势,这暗示乳酸的升高可能在中华绒螯蟹适应低氧应激中发挥巨大作用。此外,实验结果表明低氧胁迫后注射乳酸的中华绒螯蟹在急性低氧胁迫初期存活率较高。综上所述,本研究发现低氧胁迫后中华绒螯蟹低氧诱导因子Es HIF-1α和乳酸能够通过参与调控血淋巴细胞的占比来调节血淋巴细胞的功能,从而提高中华绒螯蟹对急性低氧胁迫的适应能力。

关键词：中华绒螯蟹低氧胁迫低氧诱导因子1α(HIF-1α) 乳酸血淋巴细胞

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LPS诱导细胞自噬调控长牡蛎血淋巴细胞增殖的机制初探

LPS诱导细胞自噬调控长牡蛎血淋巴细胞增殖的机制初探

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作者：张丹大连海洋大学

学位级别：硕士

造血(Haematopoiesis)是生物体维持免疫稳态的重要环节。血淋巴细胞是无脊椎动物主要的免疫细胞,其增殖和分化是无脊椎动物免疫防御的重要基础。在高等动物的免疫防御过程中,细胞自噬通过调节免疫细胞的增殖和分化来增强固有免疫,实现... 详细信息

造血(Haematopoiesis)是生物体维持免疫稳态的重要环节。血淋巴细胞是无脊椎动物主要的免疫细胞,其增殖和分化是无脊椎动物免疫防御的重要基础。在高等动物的免疫防御过程中,细胞自噬通过调节免疫细胞的增殖和分化来增强固有免疫,实现抗原呈递,清除病原并抑制炎症反应。而有关无脊椎动物细胞自噬对血淋巴细胞增殖调控的研究鲜有报道。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用荧光定量PCR、Western blot、流式细胞术及细胞免疫荧光染色等方法,查明ROS水平对长牡蛎血淋巴细胞增殖的影响,探究ROS诱导血淋巴细胞自噬的机制,初步揭示长牡蛎抗细菌免疫中细胞自噬对血淋巴细胞增殖的潜在调控作用,取得的研究结果如下:***刺激后ROS上升,促进长牡蛎血淋巴细胞增殖分别注射海水(sea water,SW),脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)后,检测长牡蛎血淋巴细胞内ROS水平,结果显示,LPS刺激后血淋巴细胞中的ROS水平显著高于SW组,而NAC刺激后血淋巴细胞中的ROS水平显著低于SW组。同时,血淋巴细胞中Ed U阳性细胞(Ed U细胞)的比例差异显著,其中,LPS刺激12 h和24 h后Ed U细胞的比例显著高于SW组,分别为SW组的2.98倍(p细胞的比例显著低于SW组,分别为SW组的0.27倍(p细胞、半粒细胞和颗粒细胞比例显著升高,分别为SW组的2.22倍(p细胞、半粒细胞和颗粒细胞比例显著升高,分别为SW组的1.88倍(p细胞和颗粒细胞的比例显著降低,分别为SW组的0.24倍(p细胞、半粒细胞和颗粒细胞的比例显著降低,分别为SW组的0.31倍(p细胞的增加。***刺激后ROS上升,诱导长牡蛎血淋巴细胞自噬运用RT-PCR及Western blot方法,检测了SW、LPS、NAC刺激后长牡蛎血淋巴细胞Cg LC3 m RNA和蛋白水平的表达变化,RT-PCR结果显示,LPS处理后12 h,Cg LC3 m RNA的相对表达水平显著上升,为SW组的1.25倍(p细胞术及细胞免疫荧光染色方法分析发现,LPS刺激12 h和24 h后自噬体CYTO-ID标记的血淋巴细胞的比例显著高于SW组,分别为SW组的1.17倍(p血淋巴细胞比例显著低于SW组,分别为SW组的0.41倍(p血淋巴细胞中观察到自噬体的绿色荧光斑点增加,而在NAC处理后的血淋巴细胞中几乎未见绿色荧光信号。以上研究表明,LPS刺激后ROS水平增加诱导了长牡蛎血淋巴细胞自噬的发生。***诱导细胞自噬调控长牡蛎颗粒细胞增殖为了探究细胞自噬在LPS诱导的细胞增殖中的潜在作用,采用氯化铵(Ammonium chloride,NHCl)抑制自噬体的降解。结果显示,在LPS+NHCl组,自噬体CYTO-ID标记的血淋巴细胞比例相较LPS组显著上升,为LPS组的1.27倍(p细胞占总血淋巴细胞的比例相较LPS组显著上升,为LPS组的1.22倍(p血淋巴细胞中Ed U无粒细胞和半粒细胞的比例显著降低,分别为LPS组的0.51倍(p细胞的比例显著升高,为LPS组的1.70倍(p血淋巴细胞自噬体降解,促进颗粒细胞增殖,提示LPS诱导细胞自噬调控长牡蛎颗粒细胞

关键词：增殖血淋巴细胞细胞自噬抗细菌免疫长牡蛎

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长牡蛎Toll样受体3对血淋巴细胞增殖的调控作用

长牡蛎Toll样受体3对血淋巴细胞增殖的调控作用

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作者：刘金宇大连海洋大学

学位级别：硕士

血淋巴细胞是无脊椎动物最主要的免疫细胞,能通过吞噬作用清除入侵病原,在机体免疫防御中发挥重要作用。在机体的免疫应答中,血淋巴细胞的增殖是快速提升机体免疫防御能力的关键步骤,但其具体作用机理尚不明确。免疫识别是机体识别和区... 详细信息

血淋巴细胞是无脊椎动物最主要的免疫细胞,能通过吞噬作用清除入侵病原,在机体免疫防御中发挥重要作用。在机体的免疫应答中,血淋巴细胞的增殖是快速提升机体免疫防御能力的关键步骤,但其具体作用机理尚不明确。免疫识别是机体识别和区分外来物质的过程,是免疫系统为保护机体免受病原体入侵而进行的初步防御。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)作为机体固有免疫应答中典型的模式识别受体,在激活机体多种免疫防御功能中发挥重要作用,并被发现可以直接调节细胞增殖和存活。和脊椎动物相比,无脊椎动物基因组中TLR信号相关基因数量显著扩张,特别是长牡蛎(Crassostrea gigas)基因组中预测出83个TLR基因,为研究TLR分子的结构和功能多样性提供了可能。目前,在长牡蛎免疫防御中的研究表明,病原刺激能显著诱导血淋巴细胞增殖并增加血淋巴细胞总数,但血淋巴细胞增殖的调节机制仍不明确,TLR信号在调节血淋巴细胞增殖中的潜在作用仍不清楚。本研究以无脊椎动物长牡蛎为研究对象,借助生物信息学分析、RNA干扰、荧光定量PCR、流式细胞术等技术手段和方法,鉴定了Toll样受体3,初步探究了长牡蛎Cg TLR3对血淋巴细胞增殖的调控作用,取得的主要结果如下:1.鉴定出长牡蛎Cg TLR3基因并明确了其保守的分子结构特征在长牡蛎基因组中筛选出CgTLR3基因。其开放阅读框序列长度为2166 bp,预测其蛋白分子量约为83.55 k Da。Cg TLR3的6个LRR结构域、1个跨膜区以及1个TIR结构域与TLR家族保守结构域相似。Cg TLR3在进化上较为保守,分子进化关系表明其与欧洲扁平牡蛎(Ostrea edulis)等无脊椎动物的TLR聚为一支。2.明确了Cg TLR3对多种配体的识别特征,并检测了其与接头蛋白的结合活性利用原核表达和蛋白纯化技术,分别得到了Cg TLR3的胞外配体结合结构域(r Cg TLR3-LRR)以及与下游接头蛋白结合的胞内结构域(r Cg TLR3-TIR)的重组蛋白,并利用胞内段重组蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体。通过ELISA检测,发现r Cg TLR3-LRR重组蛋白与peptidoglycan(PGN),mannan(MAN),lipopolysaccharide(LPS)和poly(I:C)四种PAMPs存在结合能力,结果表明,Cg TLR3胞外段重组蛋白对LPS的结合活性呈剂量依赖型升高,对其他三种PAMPs的结合活性呈先升高后趋于平稳的趋势。利用Western blotting检测Cg TLR3的胞外段重组蛋白(r Cg TLR3-LRR)与Vibrio splendidus(***),Escherichia coli(***),Micrococcus luteus(***),Staphylococcus aureus(***)四种细菌以及真菌Pichia pastoris(***)的结合活性。结果显示,重组Cg TLR3(r Cg TLR3-LRR)能够与革兰氏阴性、阳性菌及真菌结合,它的结合活性从大到小依次为***>***>***>***>***。利用生物膜干涉技术检测Cg TLR3与Cg My D88-2之间的相互作用,结果发现Cg TLR3胞内段重组蛋白与r Cg My D88-2能够结合,其二者结合常数(KD)值为7.22×10-7 M。3.发现Cg TLR3主要在长牡蛎颗粒细胞中表达,并在病原刺激后表达水平显著升高采用q RT-PCR技术检测Cg TLR3在长牡蛎不同组织(血淋巴、鳃、闭壳肌、唇瓣、肝胰腺、外套膜、性腺)中的表达水平,发现Cg TLR3的m RNA表达水平在血淋巴中最高,是性腺(表达量最低)中的87.34倍(p血淋巴细胞中主要分布在血淋巴细胞的细胞膜上。进而利用流式细胞仪检测Cg TLR3在三类血淋巴细胞亚群中的分布,发现其在颗粒细胞中分布最多,FITC+细胞在颗粒细胞中比例分别是半粒细胞和无粒细胞的2.57倍(p细胞中表达量最高,分别是半粒细胞和无粒细胞的7.27倍(p血淋巴细胞中的表达变化表明,Cg TLR3的表达在刺激后的6 h开始上升,12 h达到最高,分别为对照组的2.93倍(p血淋巴细胞的增殖和吞噬的过程具有调控作用通过注射

关键词：长牡蛎 Toll样受体颗粒细胞血淋巴细胞增殖

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CgWnt-1信号对长牡蛎免疫应答过程中血淋巴细胞增殖的调节作用

CgWnt-1信号对长牡蛎免疫应答过程中血淋巴细胞增殖的调节作用

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作者：吴莎莎大连海洋大学

学位级别：硕士

血淋巴细胞作为重要的免疫细胞,在无脊椎动物的免疫防御中发挥至关重要的作用。在机体应对病原入侵的免疫应答过程中,血淋巴细胞发生大量增殖,细胞数量快速增加以有效清除病原,但其具体调节机制仍不明确。已有研究表明,Wnt信号通路不仅... 详细信息

血淋巴细胞作为重要的免疫细胞,在无脊椎动物的免疫防御中发挥至关重要的作用。在机体应对病原入侵的免疫应答过程中,血淋巴细胞发生大量增殖,细胞数量快速增加以有效清除病原,但其具体调节机制仍不明确。已有研究表明,Wnt信号通路不仅在调节多细胞动物的胚胎发育如体轴形成、器官发生等过程中扮演着重要的角色外,同时也在调节成体组织细胞的命运决定、增殖分化和再生中不可或缺。本实验以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,探究Wnt信号通路对免疫应答过程中血淋巴细胞增殖的调控作用,取得的主要研究结果如下:1.发现长牡蛎Cg Wnt-1主要分布在血淋巴细胞细胞膜上利用长牡蛎转录组数据分析了Cg Wnt-1在胚胎发育不同阶段的表达水平,发现Cg Wnt-1 m RNA在稚贝期表达量最高,为担轮幼虫期表达量的26.91倍。在成体不同组织中均能检测到Cg Wnt-1 m RNA的表达,Cg Wnt-1蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞膜上。2.筛选获得了Cg Wnt-1的潜在受体Cg Frizzled-5。利用生物膜干涉技术发现r Cg Wnt-1与r Cg Frizzled-5、r Cg Frizzled-7、r Cg Frizzled-9和r Cg Frizzled-10之间存在相互作用,结合常数分别为K=4.32×10 M、K=1.61×10 M、K=1.25×10 M和K=1.81×10 M,其中r Cg Wnt-1与r Cg Frizzled-5结合能力最强。进一步分析Cg Frizzled-5的表达及分布特征发现,Cg Frizzled-5 m RNA在胚胎发育的桑葚期表达量最高,为幼贝期表达量的6.86倍,在成体不同组织中均能检测到表达。Cg Frizzled-5蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞膜上。3.发现免疫刺激能显著诱导Cg Wnt-1信号的激活灿烂弧菌***刺激后,长牡蛎血淋巴细胞中Cg Wnt-1的m RNA表达量在3 h,12 h,24 h和48 h显著升高,分别为对照组的3.31倍(p血淋巴细胞中Cgβ-catenin的表达量显著升高,为r TRX组的4.86倍(p血淋巴细胞中Cgβ-catenin的m RNA表达量显著降低,为对照组的0.58倍(p血淋巴细胞的增殖体内注射重组蛋白r Cg Wnt-1后,结果显示长牡蛎血淋巴细胞中造血相关因子(Cg Runx-1和Cg GATA-3)细胞周期相关蛋白(Cg CDC-45和Cg CDK-2)的m RNA表达量显著升高,分别为r TRX组的9.33倍(p血淋巴细胞中Ed U细胞的比例显著增加,为对照组(r TRX)的2.88倍(p<0.05)。当Wnt信号抑制剂C59与r Cg Wnt-1同时注射时

关键词：长牡蛎 Wnt信号通路 Wnt-1 血淋巴细胞增殖

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CgAstakine及其受体对长牡蛎血淋巴细胞增殖的调节作用

CgAstakine及其受体对长牡蛎血淋巴细胞增殖的调节作用

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作者：杨莹大连海洋大学

学位级别：硕士

循环血淋巴细胞是无脊椎动物抵御环境胁迫或病原侵染的主要免疫细胞,参与吞噬、包囊等免疫过程,在固有免疫中发挥重要作用。血淋巴细胞的增殖分化是造血的重要过程,也是维持免疫稳态的重要的机制,受到造血转录因子、细胞因子及其信号通... 详细信息

循环血淋巴细胞是无脊椎动物抵御环境胁迫或病原侵染的主要免疫细胞,参与吞噬、包囊等免疫过程,在固有免疫中发挥重要作用。血淋巴细胞的增殖分化是造血的重要过程,也是维持免疫稳态的重要的机制,受到造血转录因子、细胞因子及其信号通路等多种因素的调控。研究表明,细胞因子在高等动物免疫细胞增殖分化过程中发挥重要的调控作用,但目前无脊椎动物细胞因子及其在调控血淋巴细胞增殖分化中的作用研究仍处于起步阶段。Astakine是无脊椎动物特有的一类细胞因子,目前主要在淡水小龙虾、凡纳滨对虾和中华绒螯蟹等节肢动物中被发现。本研究以软体动物长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,在实验室前期鉴定的Astakine(CgAstakine)基础上,综合利用生物信息学、荧光定量PCR、Western blot及流式细胞术等技术方法,鉴定了CgAstakine的受体ATP synthaseβsubunit(命名为CgATP synthaseβsubunit),探究了CgATP synthaseβsubunit与CgAstakine的相互作用及二者对血淋巴细胞增殖的调控作用,取得的研究结果如下:*** synthaseβsubunit的分子结构和表达特征从长牡蛎中克隆得到CgATP synthaseβsubunit。CgATP synthaseβsubunit的开放阅读框长为1575 bp,编码含524个氨基酸,预测蛋白分子量为56.57 k Da的多肽。CgATP synthaseβsubunit含有1个保守的ATP-synt＿ab＿N结构域和1个AAA结构域。CgATP synthaseβsubunit在长牡蛎的闭壳肌、外套膜、唇瓣、肝胰腺、鳃、性腺和血淋巴细胞中均有表达,其在肝胰腺和鳃中的表达量最高,分别为唇瓣的109.11倍(p细胞免疫荧光染色结果显示,CgATP synthaseβsubunit蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞膜上。***对血淋巴细胞增殖的调控作用注射重组CgAstakine蛋白(rCgAstakine)后,长牡蛎血淋巴细胞中EdU阳性细胞的比例显著升高,在6 h和12 h时分别是海水组的2.24倍(p细胞标记分子CgSOX11和CgAATase、透明细胞标记分子CgCD9的mRNA表达水平均显著升高,其中CgSOX11的表达量在12 h和24 h时分别是海水组的2.86倍(p血淋巴细胞中CgAATase的蛋白表达水平显著增加。*** synthaseβsubunit与CgAstakine的相互作用体外原核表达获得rCgAstakine和rCgATP synthaseβsubunit蛋白,并通过生物膜干涉技术(Bio-layer interferometry,BLI)证明了二者之间具有较强的结合活性,结合常数为8.21×10。注射rCgAstakine 24 h后,CgATP synthaseβsubunit在透明细胞和半粒细胞中的mRNA表达量均显著升高,分别是海水组的2.44倍和9.01倍(p细胞中的mRNA表达量均显著增加,分别是海水组的1.83倍(p细胞和颗粒细胞中的蛋白表达量也显著增加,分别为海水组组的1.64倍(p细胞中CgATP synthaseβsubunit蛋白表达量与海水组相比没有显著性变化。*** synthaseβsubunit和CgJAK2对血淋巴细胞增殖的调控作用利用RNAi技术干扰CgATP synthaseβsubunit的表达后,流式细胞术检测到血淋巴细胞中EdU阳性细胞的比例显著降低,为Negative control(NC)组的0.28倍(p细胞中EdU阳性细胞的比例显著降低,为NC组的0.89倍(p细胞和半粒细胞中EdU阳性细胞的比例与NC组相比并无显著性变化。上述结果表明CgATP

关键词：长牡蛎造血作用增殖血淋巴细胞 CgAstakine CgATP synthase β subunit

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细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库构建及巨噬细胞表达蛋白cDNA的克隆与差异表达

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遗传 2008年第8期30卷 1043-1050页

作者：任洪林徐丹丹乔琨蔡灵黄伟滨张鼐王克坚近海海洋环境科学国家重点实验室厦门大学海洋与环境学院

以雌性杂色鲍为对象,以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌,利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSHcDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子,进行菌液PCR鉴定,... 详细信息

以雌性杂色鲍为对象,以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌,利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSHcDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子,进行菌液PCR鉴定,计算文库重组率为98.18%,文库容量为1.37×106pfu。将重组子测序,经BLAST一致性搜索比对分析,有一重组片段含有穿孔素(Perforin)保守结构域,为巨噬细胞表达蛋白(MEP)类穿孔素部分cDNA序列,片段大小为1551bp,连续编码517个氨基酸残基,申请GenBank登录号为EU272049。经半定量PCR和荧光定量PCR差异显示分析,发现在细菌感染状态下MEP基因在血淋巴细胞中存在明显的上调表达现象。

关键词：杂色鲍血淋巴细胞细菌抑制性差减杂交巨噬细胞表达蛋白类穿孔素差异表达分析

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平肝潜阳方对偏头痛肝阳上亢证大鼠血淋巴细胞蛋白质表达的影响

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中南大学学报（医学版） 2010年第1期35卷 70-76页

作者：钟广伟胡建军陈泽奇罗艳红张莺尹耀慧李炜易振佳陈国林中南大学湘雅医院中西医结合研究所中南大学湘雅医院急诊科长沙410008

目的:探讨平肝潜阳方对偏头痛肝阳上亢证大鼠作用的分子机制。方法:用电刺激SD大鼠三叉神经节的方法并灌服附子汤复制偏头痛肝阳上亢证模型,采用平肝潜阳方中药进行干预。运用双向凝胶电泳技术分离偏头痛肝阳上亢证大鼠血淋巴细胞的总蛋... 详细信息

目的:探讨平肝潜阳方对偏头痛肝阳上亢证大鼠作用的分子机制。方法:用电刺激SD大鼠三叉神经节的方法并灌服附子汤复制偏头痛肝阳上亢证模型,采用平肝潜阳方中药进行干预。运用双向凝胶电泳技术分离偏头痛肝阳上亢证大鼠血淋巴细胞的总蛋白,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图,搜索数据库鉴定蛋白质。结果:平肝潜阳方能够明显改善偏头痛大鼠的头痛等症状,得到分辨率及重复性较好的正常大鼠、偏头痛肝阳上亢证大鼠、中药治疗大鼠血淋巴细胞的双向凝胶电泳图谱;共得到13肽质量指纹图谱,2个无质谱结果,搜索到具有统计学意义的蛋白质11个,包括乙醇脱氢酶3,糖原磷酸化酶,ATP合酶D链,膜联蛋白-3,泛素,中性粒细胞防御素4前体,黑素瘤相关性E2抗原,热休克蛋白-27,膜联蛋白-A1,硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅱ,谷胱甘肽合成转移酶片断。结论:平肝潜阳方治疗后的偏头痛肝阳上亢证大鼠血淋巴细胞蛋白质的表达与治疗前比较有差异,所鉴定的11个蛋白质可能与平肝潜阳方的作用机制有关。

关键词：平肝潜阳方蛋白质组学偏头痛肝阳上亢证血淋巴细胞

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静脉免疫球蛋白对新生儿脐带血淋巴细胞免疫抑制机制的研究

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中华儿科杂志 2005年第6期43卷 438-443页

作者：郝轶群陈同辛朱亚忠李庆生上海第二医科大学附属新华医院上海市儿科医学研究所免疫/肿瘤研究室 200092

目的从脐带血单个核细胞(CBMC)和CD3+T淋巴细胞膜表面CD25、CD45RA、CD45RO分子表达的角度,探讨静脉免疫球蛋白(IVIG)对新生儿免疫功能的抑制机制。方法利用IVIG和植物血凝素(PHA)不同组合对CBMC或CD3+T淋巴细胞进行刺激培养,再利用四... 详细信息

目的从脐带血单个核细胞(CBMC)和CD3+T淋巴细胞膜表面CD25、CD45RA、CD45RO分子表达的角度,探讨静脉免疫球蛋白(IVIG)对新生儿免疫功能的抑制机制。方法利用IVIG和植物血凝素(PHA)不同组合对CBMC或CD3+T淋巴细胞进行刺激培养,再利用四色免疫荧光抗体标记-流式细胞技术检测细胞表面CD25、CD45RA、CD45RO分子的表达情况。结果IVIG可以抑制PHA诱导的CBMC的活化,表现为CD25分子表达的明显抑制;并且随着CD25分子表达的抑制,CD4+细胞表面的CD45RO分子的表达也被抑制,阻止了CBMC中的CD4+CD45RA+细胞向CD4+CD45RO+细胞转换。IVIG也可以抑制PHA诱导的脐带血CD3+T淋巴细胞CD25分子和CD45RO分子的表达,但这种抑制程度远远不如对CBMC作用明显。结论IVIG可以抑制脐带血T淋巴细胞的活化过程,这种抑制作用除了与IVIG对T淋巴细胞的直接作用外,还可能通过了其他免疫细胞或免疫分子的间接介导。IVIG对CD4+CD45RO+T淋巴细胞的抑制作用可能是IVIG抑制B淋巴细胞免疫球蛋白释放的重要机制之一。新生儿期应用IVIG有可能使免疫功能低下加重。

关键词：静脉免疫球蛋白免疫抑制机制血淋巴细胞新生儿脐带 CD45RO分子 CD25分子表达 CD45RA^+细胞 T淋巴细胞脐带血单个核细胞 CD3^+ IVIG 细胞免疫球蛋白 CD4^+ CBMC 荧光抗体标记免疫功能低下细胞表面抑制作用植物血凝素

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