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类风湿关节炎患者HLA—DR4／1表型与流感病毒血凝素特异性T细胞增殖及其抗体的关系

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中华医学杂志 2008年第27期88卷 1881-1883页

作者：李霞李茹栗占国大连大学医学院免疫教研室 116622 北京大学人民医院临床免疫中心/风湿免疫科

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者人类白细胞抗原（HLA）-DR4／1表型与流感病毒血凝素（HA）308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系。方法将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞（PBMC）共孵育5d，^3H掺入... 详细信息

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者人类白细胞抗原（HLA）-DR4／1表型与流感病毒血凝素（HA）308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系。方法将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞（PBMC）共孵育5d，^3H掺入法测定T细胞增殖。用ELISA法检测RA患者血清HA308-317抗体水平。以序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术对RA患者进行HLA-DR分型。结果在70例RA患者中，27例HLA-DR4／1表型阳性。其中，HA308-317多肽可刺激T细胞增殖的RA患者有17例（62.9％），10例无反应性；15例（55．6％）HLA-DR4／阳性RA患者抗HA308-317抗体阳性。在HLA-DR4／1表型阴性的RA患者中，T细胞对HA308-317多肽有反应性者10例（23．3％），无反应性者33例；25例（58．1％）患者抗HA308-317抗体阳性。HLA-DR4／1表型阳性组HA308-317特异性细胞增殖高于HLA-DR4／1表型阴性组（P〈0．01），但两组血清中HA308—317抗体水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论RA患者HA308-317特异性T细胞增殖与HLA-DR4／1表型有关，HA308-317抗体生成与HLA-DR4／1亚型无明显关系；HA308—317多肽可能通过诱导HLA-DR4／1特异性T细胞活化参与RA的发病。

关键词：关节炎,类风湿血凝素糖蛋白类,流感病毒 HLA-DR抗原抗体 T淋巴细胞

甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

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中国生物制品学杂志 2011年第9期24卷 1007-1012页

作者：付金奇郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇张乐萃张智清青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿... 详细信息

目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA。rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达。结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确;第3代rBac-HA的滴度为3×107 pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA(H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白。

关键词：血凝素糖蛋白类,流感病毒杆状病毒 sf9细胞

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

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中国生物制品学杂志 2011年第4期24卷 379-383页

作者：郭建强陈爱珺姚立红刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染... 详细信息

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。

关键词：血凝素糖蛋白类,流感病毒哺乳动物细胞稳定表达

流感病毒裂解疫苗及单价病毒液的血凝素稳定性研究

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国际生物制品学杂志 2007年第2期30卷 49-52页

作者：杨菲茹周锋裘索陈菲许友明上海生物制品研究所生物技术制品中心 200052 上海生物制品研究所质量保证部 200052

目的通过对连续三年生产的流行性感冒（流感）病毒裂解疫苗成品和单价病毒液（MVP）血凝素（HA）的定期检测，了解成品和MVP的HA含量的变化情况，以便更准确、有效地配制半成品。方法 2003-2005年，每年选择一定数量的成品和MVP，按一... 详细信息

目的通过对连续三年生产的流行性感冒（流感）病毒裂解疫苗成品和单价病毒液（MVP）血凝素（HA）的定期检测，了解成品和MVP的HA含量的变化情况，以便更准确、有效地配制半成品。方法 2003-2005年，每年选择一定数量的成品和MVP，按一定时间间隔抽样，采用单向免疫扩散法检测成品和MVP的HA含量。观察期至少为1年。结果成品存放至半年，HA含量都在控制范围之内。但存放至1年，个别毒株HA含量降至低于控制范围。MVP的HA稳定性因毒株的不同而异。结论一般情况下，流感疫苗在成品检定合格后7个月内完成使用，因此，在此期间，成品的HA含量在合格范围之内。不同毒株的MVP，HA降幅不同，可能是由于编码HA蛋白的RNA4节段的核苷酸序列在不同亚型，甚至在同一亚型不同变异株间的差异所造成的。

关键词：流感疫苗血凝素糖蛋白类,流感病毒单价病毒液稳定性

人禽流感H5N1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

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解放军医学杂志 2009年第6期34卷 695-700,710页

作者：夏玉坤刘伯华杨保安李靖张永国车小燕祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 南方医科大学珠江医院临床基础研究所

目的确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区。方法将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片。利用灭活... 详细信息

目的确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区。方法将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片。利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/c小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性,确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区。结果成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性。利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位。结论利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HAMcAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据。

关键词：流感病毒A型,H5N1亚型血凝素糖蛋白类,流感病毒表位

人IgG Fc标签融合表达载体的构建及H5 HA1融合蛋白的表达

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中国生物制品学杂志 2011年第10期24卷 1130-1133页

作者：赵荣茂郭丽吴超王健伟洪涛北京协和医学院中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室北京100730

目的构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白。方法以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体。将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293... 详细信息

目的构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白。方法以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体。将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293T细胞,进行融合蛋白的表达。表达的蛋白经Protein G亲和层析一步法纯化。结果人IgG Fc标签融合表达载体经酶切及测序证明构建正确;在293T细胞中分泌表达的H5 HA1与人IgG Fc的融合蛋白HA1-Fc相对分子质量约75 000,转染后72和96 h表达量最高;纯化的融合蛋白纯度达90%以上,含量为1.63μg/ml。结论成功构建了人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化了HA1-Fc融合蛋白,为流感病毒侵入及免疫机制的研究奠定了基础。

关键词：免疫球蛋白Fc片段血凝素糖蛋白类,流感病毒融合蛋白

泉州市流感疫情实验室检测及H3N2亚型基因特性分析

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中华检验医学杂志 2011年第1期34卷 55-57页

作者：郑友限陈明春王耿龚彩婷陈杰毅林锦忠泉州市疾病预防控制中心 362000

目的了解2009年泉州地区流感流行及病毒株的变异情况,探讨流感病毒基因的变异与流感流行的关系.方法对泉州市198例流感患者的咽拭子采用MDCK细胞培养进行病毒分离,经血清学试验鉴定分型和实时荧光RT-PCR方法检测病毒核酸.对其中4株毒... 详细信息

目的了解2009年泉州地区流感流行及病毒株的变异情况,探讨流感病毒基因的变异与流感流行的关系.方法对泉州市198例流感患者的咽拭子采用MDCK细胞培养进行病毒分离,经血清学试验鉴定分型和实时荧光RT-PCR方法检测病毒核酸.对其中4株毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAstar megalign软件分析基因.结果 198份咽拭子中有98份为H3N2亚型流感病毒核酸阳性,分离到62株H3N2亚型流感病毒,HA1基因经核苷酸序列测定显示,其基因特性更接近于A/Ningbo/333/2008,核苷酸同源性为98.7%,与A/Xiamen/70/2004的同源性为96.8%,由HA1基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/10/2007相比,有7个氨基酸位点发生变异,其中有1个位点位于抗原决定簇A区（144）,有2个位点位于抗原决定簇B区（158、189）,种系发生树分析也证实HA1基因存在一定差异.结论引起2009年泉州市流感在部分集体单位流行的病毒为H3N2亚型,其基因特性和抗原性与疫苗株相比均发生了一定变异.

关键词：流感,人流感病毒A型,H3N2亚型血凝素糖蛋白类,流感病毒碱基序列

乙型流感疫苗生产用毒株NYMC BX-51B主要抗原的基因特征及传代稳定性研究

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国际生物制品学杂志 2015年第2期38卷 58-62页

作者：刘朝阳程鹏飞闫现伟郁佳俊毛树宝上海生物制品研究所有限责任公司质量检定室 200051 上海生物制品研究所有限责任公司生产部 200051

目的了解2013年流感疫苗生产用乙型病毒株NYMC BX-51B主要抗原血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的基因特征,并研究该疫苗株的传代稳定性.方法对制备的乙型流感病毒株主种子批、工作种子批及收获液病毒进... 详细信息

目的了解2013年流感疫苗生产用乙型病毒株NYMC BX-51B主要抗原血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的基因特征,并研究该疫苗株的传代稳定性.方法对制备的乙型流感病毒株主种子批、工作种子批及收获液病毒进行全面的生物学特性检定.采用逆转录-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析.对7株不同年份的乙型疫苗株及野毒株的HA氨基酸序列进行比对,绘制氨基酸种系发生树.结果该毒株主种子批和工作种子批的抗原性与WHO2013年推荐的毒株一致,种子批和收获液病毒的生物学特性均符合我国2010年版药典标准.HA基因序列长度为1 755 bp,编码584个氨基酸;NA基因序列长度为1 401 bp,编码466个氨基酸.各代次流感病毒HA和NA的基因核苷酸和氨基酸序列均相同,与GenBank发布的序列完全一致,同源性为100％.2013年乙型疫苗株的HA氨基酸序列与2010和2012年相比,同源性分别为94.3％和98.4％.结论 2013年乙型流感疫苗株NYMCBX-51B主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合我国药典要求.2013年疫苗株的HA氨基酸序列与2010年相比进化距离较远.

关键词：流感疫苗流感病毒B型血凝素糖蛋白类,流感病毒神经氨酸酶

血细胞凝聚素和神经氨酸酶协同突变对甲型H1N1流行性感冒病毒特性的影响

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中华传染病杂志 2021年第9期39卷 571-574页

作者：刘百怡高燕北京大学人民医院感染科 100044

甲型H1N1流行性感冒(以下简称流感)病毒为主要流行的流感病毒亚型,极易发生突变。血细胞凝聚素和神经氨酸酶是流感病毒表面两种重要的膜蛋白,相应的基因突变会导致这两种蛋白质发生变异,对流感病毒的复制能力、病毒毒力、神经氨酸酶活... 详细信息

甲型H1N1流行性感冒(以下简称流感)病毒为主要流行的流感病毒亚型,极易发生突变。血细胞凝聚素和神经氨酸酶是流感病毒表面两种重要的膜蛋白,相应的基因突变会导致这两种蛋白质发生变异,对流感病毒的复制能力、病毒毒力、神经氨酸酶活性、耐药性和免疫逃逸特性的改变起关键作用。甲型H1N1流感病毒特性的改变可能会对公共卫生产生重大威胁。现从复制能力、毒力、耐药性等方面,对血细胞凝聚素和神经氨酸酶协同突变影响甲型H1N1流感病毒特性的研究进展进行综述,为今后流感病毒特性的研究、疫苗的研发和临床用药提供参考。

关键词：血凝素糖蛋白类,流感病毒神经氨酸酶流感病毒A型,H1N1亚型协同突变生物学特性