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表达呼吸道合胞病毒融合前f蛋白的重组人5型腺病毒的构建

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中国人兽共患病学报 2023年第6期39卷 515-522页

作者：马亚林柴鹏弟王金冬毛彤瑶张鹏李慧莹段招军甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206 潍坊医学院潍坊261000

目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象f蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表... 详细信息

目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象f蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV f蛋白编码序列,利用融合前f蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV f蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象f蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定f蛋白的表达及构象。结果通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV f蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到2.016×10^(10),2.52×10^(10)和2.948×10^(11)IU/mL。pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的f蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中f蛋白表达量高于pAd5-SC-3M。结论成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前f蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。

关键词：人5型腺病毒载体人呼吸道合胞病毒融合前f蛋白 HEK293细胞

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重组呼吸道合胞病毒融合前构象f蛋白的非复制型5型腺病毒载体疫苗的研究

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重组呼吸道合胞病毒融合前构象F蛋白的非复制型5型腺病毒载体疫苗...

作者：马亚林甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:呼吸道合胞病毒疫苗在即将获批背景下,疫苗的研发思路也将发生改变,体内的免疫环境将由自然感染和肌肉注射疫苗共同建立。考虑到人体复杂的免疫环境,构建重组呼吸道合胞病毒融合前构象f蛋白的非复制型5型腺病毒载体疫苗进行研究,... 详细信息

目的:呼吸道合胞病毒疫苗在即将获批背景下,疫苗的研发思路也将发生改变,体内的免疫环境将由自然感染和肌肉注射疫苗共同建立。考虑到人体复杂的免疫环境,构建重组呼吸道合胞病毒融合前构象f蛋白的非复制型5型腺病毒载体疫苗进行研究,口服和肌注免疫BALB/c小鼠,进行疫苗间抗体水平的比较,规避呼吸道增强疾病(ERD)的发生,为成功开发安全、有效的呼吸道合胞病毒疫苗提供理论依据。方法:呼吸道合胞病毒融合前f蛋白重组5型腺病毒载体疫苗研究内容包括:(1)通过真核表达pcDNA3.1(+)系统对不同突变体HRSV f蛋白序列筛选,单克隆抗体AM14和D25特异性识别HRSV f蛋白融合前构象抗原表位Site V和Site(?),利用双抗夹心ELISA方法筛选稳定的融合前构象f蛋白编码序列。(2)将实验筛选的融合前构象f蛋白编码序列与非复制型5型腺病毒载体同源重组,制备一组pAd5-SC-3M和两组添加LUC(dsRNA佐剂)载体的pAd5-SC-3MLUC和pAd5-SC-5MLUC重组5型腺病毒质粒。重组5型腺病毒质粒进行多酶切鉴定和目的基因片段PCR测序鉴定,扩增重组5型腺病毒,经氯化铯密度梯度离心方法纯化。体外实验,利用双抗夹心ELISA分析表达f蛋白构象,Western blot比较融合前f蛋白的表达量。(3)动物实验,相同免疫剂量下使用灌胃和肌注的免疫方式进行BALB/c小鼠实验。在0周和3周进行两次免疫,分别在距离初次免疫后3周、6周和9周采集实验动物的血液和粪便样本,通过间接ELISA实验方法分析抗体水平,对免疫结果进行研究。结果:(1)显示仅pcDNA3.1(+)-SC-3M和pcDNA3.1(+)-SC-5M与特异性融合前抗原表位Site V和Site(?)均发生稳定的结合,筛选出稳定表达融合前构象f蛋白编码序列。(2)制备3种呼吸道合胞病毒表达融合前构象f蛋白的重组5型腺病毒,包括pAd5-SC-3M和两组添加LUC(dsRNA佐剂)载体的pAd5-SC-3MLUC和pAd5-SC-5MLUC。氯化铯密度梯度离心纯化病毒,有限稀释方法检测病毒滴度高,表达f蛋白稳定维持在融合前构象,单体f蛋白大小68kda,与预期结果一致,pAd5-SC-5MLUC蛋白表达量较高。(3)间接ELISA检测血清中IgG抗体水平高,灌胃组pAd5-5MLUC高于pAd5-3MLUC(Pf蛋白均能维持融合前构象,体外蛋白表达量高。(2)口服和肌注的免疫BALB/c小鼠诱导产生良好的体液免疫应答和粘膜免疫应答。无论是否添加佐剂组或者通过口服和肌注的免疫方式,重组5型腺病毒载体疫苗诱导均衡Th1/Th2免疫反应,规避呼吸道增强疾病(ERD)的发生。

关键词：人呼吸道合胞病毒重组5型腺病毒融合前f蛋白口服疫苗

呼吸道合胞病毒滴度双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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国际免疫学杂志 2024年第1期47卷 33-38页

作者：王婉唐悦赵忆宁陈玥如傅生芳程亚慧李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室、甘肃省疫苗工程技术研究中心兰州730046

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度。方法以RSV融合前f蛋白的两种抗体AM14与D25作为捕获抗体和检测抗体,通过对其抗体浓度的优化来确定DAS-ELISA较适反应条件,并对该方法的特异性、重复性、灵敏度及适用性进行验证。结果选择用AM14抗体作为捕获抗体,D25作为检测抗体。捕获抗体AM14较适工作浓度为20μg/mL,检测抗体D25的稀释比例为1∶3000。建立的DAS-ELISA与轮状病毒(rotavirus,RV)和人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)无交叉反应,且不同稀释倍数的RSV病毒进行批内与批间重复试验的变异系数(coefficient of variation,CV)均蛋白进行试验,均能检测到病毒滴度;检测结果与CCID50比较,可检测的稀释倍数略高。结论建立了检测RSV滴度的DAS-ELISA,该方法可为实验室RSV病毒滴度检测提供依据。

关键词：呼吸道合胞病毒融合前f蛋白双抗体夹心ELISA 病毒滴度

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人呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

中国生物制品学杂志 2022年第10期35卷 1261-1267,1273页

作者：李海任虎(综述) 张燕许文波(审校) 国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所世界卫生组织西太平洋地区麻疹/风疹参比实验室北京102206 中国科学院生物安全大科学研究中心湖北武汉430000

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因之一,据统计全球每年因hRSV感染产生的经济负担超过800亿美元。自20世纪50年代hRSV被发现以来,国内外科研人员对hRSV疫苗进行... 详细信息

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因之一,据统计全球每年因hRSV感染产生的经济负担超过800亿美元。自20世纪50年代hRSV被发现以来,国内外科研人员对hRSV疫苗进行了大量的研发,至今尚无被批准使用的hRSV疫苗。hRSV疫苗一直面临安全性不足或免疫原性弱等巨大挑战,已有多种进入临床试验阶段的hRSV疫苗宣布“失败”。2013年,融合前f蛋白(prefusion f protein,Pre-f)构象成功解析后,以Pre-f为基础的hRSV疫苗展现出良好的应用前景,目前已有14种疫苗处于临床试验阶段,包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、亚单位疫苗和颗粒疫苗等。本文就hRSV疫苗研发面临的挑战以及最新研究进展作一综述。

关键词：人呼吸道合胞病毒疫苗融合前f蛋白

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