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蝗绿僵菌跨膜蛋白MaOpy2的功能研究

蝗绿僵菌跨膜蛋白MaOpy2的功能研究

作者：樊钰重庆大学

学位级别：硕士

昆虫病原真菌是一种重要的生防资源,由于其扩散效果可观,对环境友好,害虫不易产生抗性,具有很好的应用潜力。但是,杀虫真菌农药田间防效不稳定,杀虫速度慢,生产成本高等不足,限制其广泛应用。分生孢子作为昆虫病原真菌的主要侵染单元,... 详细信息

昆虫病原真菌是一种重要的生防资源,由于其扩散效果可观,对环境友好,害虫不易产生抗性,具有很好的应用潜力。但是,杀虫真菌农药田间防效不稳定,杀虫速度慢,生产成本高等不足,限制其广泛应用。分生孢子作为昆虫病原真菌的主要侵染单元,具有良好的抗逆和耐储藏能力,是杀虫真菌农药的主要有效成分,也是引起真菌在昆虫病种群中流行的重要因素。因此,昆虫病原真菌孢子的质量和产量直接决定杀虫真菌农药的生产成本和防治效果。所以,阐明孢子产量和质量调控的分子机制,可望为提高杀虫真菌孢子产率、孢子质量(抗逆、耐储藏等特性)及持续控制害虫的能力提供理论和技术,促进杀虫真菌农药发展。Opy2是HOG-MAPK信号途径Sho1分支上游一个重要的膜锚定蛋白,在HOG-MAPK和Fus3/Kss1 MAPK通路中都扮演着重要角色,与真菌的生长发育和侵染致病密切相关,但Opy2蛋白在模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌中的功能未见报道。本研究采用敲除和回复策略,系统阐明了蝗绿僵菌中Opy2的功能。通过生物信息学分析发现,蝗绿僵菌中MaOpy2基因编码区全长为1362 bp,编码434个氨基酸,其N端有一个跨膜结构域。表型分析发现,相较于野生型菌株(WT)和回复菌株(CP),MaOpy2敲除菌株(ΔMaOpy2)的紫外耐受性和抗湿热能力显著降低,其半抑制时间IT分别降低了约1.6 h和3.68 h,对细胞壁破坏剂敏感性增加,抗氧化能力和应对高渗胁迫能力与WT和CP菌株无显著差异。毒力测试结果发现,MaOpy2缺失后影响了蝗绿僵菌的致病性,体表点滴接种后,ΔMaOpy2侵染蝗虫的半致死时间(LT)延长约1.58 d,体内注射接种后,ΔMaOpy2侵染的蝗虫LT降低了约1.79 d。进一步研究发现,相较于WT,ΔMaOpy2在昆虫体表的萌发显著延迟,其半萌发时间GT延长了约2.4 h,在蝗虫后翅上培养12h后,ΔMaOpy2的附着胞形成率降低了约31%。产孢量测定结果显示,MaOpy2缺失后,蝗绿僵菌在1/4 SDAY培养基上的产孢量提高近1倍,进一步观察发现,敲除MaOpy2蝗绿僵菌产孢方式发生了转换,即由正常产孢转换为微循环产孢。RNA-seq分析筛选获得WT和ΔMaOpy2之间的差异表达基因有62个,其中上调表达基因37个,下调表达基因25个,包括多个与产孢、菌丝发育、细胞分裂及分化等过程相关的基因,表明MaOpy2通过影响产孢和菌丝发育等相关过程调控产孢方式的转换。综上所述,MaOpy2参与调控蝗绿僵菌的产孢量、产孢方式转换、抗逆能力及致病性,并通过调控产孢相关途径以及细胞分裂及分化相关基因的表达来抑制菌丝的生长,调控产孢方式的转换,进而促进分生孢子的产生。本研究结果将为阐明昆虫病原真菌的产量和质量的调控机制提供理论依据,也为昆虫病原真菌的分子改良提供理论指导和候选基因。

关键词：蝗绿僵菌 Opy2 毒力抗逆产孢

蝗绿僵菌C2H2转录因子MaVrf1的功能研究

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蝗绿僵菌C2H2转录因子MaVrf1的功能研究

作者：徐定香重庆大学

学位级别：硕士

昆虫病原真菌作为重要的生防资源,因其对人畜无害、对环境友好、害虫不易产生抗性等优点,具有广阔的开发前景。但生产成本高、防效不稳定等不足限制了杀虫真菌农药的广泛应用。分生孢子是昆虫病原真菌主要侵染体,也是杀虫真菌农药的主... 详细信息

昆虫病原真菌作为重要的生防资源,因其对人畜无害、对环境友好、害虫不易产生抗性等优点,具有广阔的开发前景。但生产成本高、防效不稳定等不足限制了杀虫真菌农药的广泛应用。分生孢子是昆虫病原真菌主要侵染体,也是杀虫真菌农药的主要有效成分,其产量和质量直接决定杀虫真菌农药的生产成本和应用效果。因此,阐明昆虫病原真菌调控孢子质量和产量的分子机制,可望为降低杀虫真菌农药的生产成本和稳定防效提供理论指导。在稻瘟菌中发现C2H2转录因子Vrf1参与附着胞成熟过程,与真菌毒力密切相关,但目前在昆虫病原真菌中该基因的功能尚未见报道。因此,本研究以模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌为材料,采用基因敲除和回复策略,通过对各菌株的表型分析明确了MaVrf1基因的功能,主要得到以下结论:蝗绿僵菌MaVrf1基因的编码序列有3个内含子,其c DNA全长为1188 bp,编码395个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为44.33 KD,等电点为7.0,N端有4个串联的C2H2锌指结构域且高度保守。MaVrf1缺失后促进分生孢子萌发,提高紫外耐受性,但不影响分生孢子产量、湿热、高渗、氧胁迫以及细胞壁破坏剂的耐受性。生物测定结果表明,MaVrf1敲除菌株的毒力显著降低,半致死时间显著长于WT和CP菌株,约为WT和CP菌株的两倍。进一步研究结果表明,ΔMaVrf1分生孢子在后翅上萌发延迟,不能形成典型附着胞。通过RNA-seq分析,发现共有864个基因在附着胞时期中发生了差异表达,对有注释的功能基因分析后,MaVrf1可能介导氧化应激、生长发育和细胞壁合成等相关基因的表达来影响附着胞的发育进而影响蝗绿僵菌毒力。此外,ΔMaVrf1在微循环产孢培养基(SYA)上无法进行微循环产孢,RNA-seq分析发现,共有57个差异表达基因,其中有14个基因与菌丝生长,细胞分裂及细胞周期相关,说明MaVrf1可能调控与菌丝生长,细胞分裂及细胞周期相关基因的表达来调控蝗绿僵菌产孢方式转换。综上所述:MaVrf1缺失后使蝗绿僵菌萌发提前,紫外耐受性增强,产孢方式发生转换,附着胞形成及穿透过程受损导致蝗绿僵菌侵染致病能力降低。本研究结果为进一步探究MaVrf1调控蝗绿僵菌产孢方式和侵染致病的分子机制奠定基础。

关键词：蝗绿僵菌 C2H2转录因子 MaVrf1 产孢方式毒力

蝗绿僵菌类钙调磷酸酶基因MaCLP的功能研究

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蝗绿僵菌类钙调磷酸酶基因MaCLP的功能研究

作者：刘喆重庆大学

学位级别：硕士

真菌杀虫剂作为化学农药的替代品,不仅使害虫不易产生抗药性,而且对环境更加友好,发展潜力巨大。然而,杀虫周期长、生产成本高以及防治效果不稳定使其大规模应用受限。绿僵菌是世界范围内研究得最多的真菌杀虫剂之一,主要活性单位是分... 详细信息

真菌杀虫剂作为化学农药的替代品,不仅使害虫不易产生抗药性,而且对环境更加友好,发展潜力巨大。然而,杀虫周期长、生产成本高以及防治效果不稳定使其大规模应用受限。绿僵菌是世界范围内研究得最多的真菌杀虫剂之一,主要活性单位是分生孢子。孢子不仅在真菌的生长繁殖和发育过程中发挥重要作用,同时也是感染宿主的主要侵染单元。研究绿僵菌的产孢、抗逆、营养利用及致病机制,可为真菌杀虫剂的开发和田间应用提供理论依据。前期研究中,我们发现类钙调磷酸酶(calcineurin-like phosphatase,CLP)是在碳源调控微循环产孢方式中上调表达的基因。有研究表明CLP与真菌孢子的生长发育和葡萄糖的利用相关。为阐明CLP在蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)生长、产孢、抗逆及毒力中的作用,本研究利用基因敲除和回复技术,获得了MaCLP的敲除菌株和回复菌株。通过对敲除菌株生长、逆境耐受性、营养利用及毒力进行分析,明确MaCLP在蝗绿僵菌中的功能。MaCLP基因登录号为MAC＿05025,生物信息学分析表明该基因全长为2326 bp,具有6个内含子,其c DNA的长度为1938bp,共编码645个氨基酸。通过同源序列分析比对发现,MaCLP具有保守的特征基序。主要研究结果如下:MaCLP缺失后影响蝗绿僵菌的生长以及产孢。在营养丰富的1/4 SDAY培养基上,ΔMaCLP菌落直径大于野生型(WT);分生孢子萌发显著延迟;产孢延迟,生长前期产孢量低于野生型,后期高于野生型。在微循环产孢培养基SYA上,ΔMaCLP产孢方式发生了转换,由微循环产孢转变为正常产孢,菌落直径显著增大。MaCLP缺失后影响蝗绿僵菌的逆境耐受性。与WT相比,ΔMaCLP湿热耐受性降低。湿热处理后,WT中MaCLP基因在第6 h时表达量最高。此时热休克蛋白基因Ssb1、泛素化蛋白基因Ubil的表达量降低。MaCLP缺失不影响绿僵菌紫外耐受性,但对高盐、高渗以及金属Mn的耐受性增强。MaCLP负调控蝗绿僵菌对营养的利用。ΔMaCLP在不同碳源和氮源培养基上的菌落生长速率显著增加,产孢量增加。对蝗虫进行生测显示,MaCLP缺失后不影响蝗绿僵菌的毒力。酵母双杂交显示,MaCLP与氮源代谢相关蛋白MaGS1、MaAmd S,糖酵解途径的Ma PFK,热休克蛋白MaWos2间存在互作。综上所述,MaCLP可能通过影响碳氮代谢的相关基因来调控蝗绿僵菌的生长、产孢、营养利用、逆境耐受性以及毒力的能力。

关键词：蝗绿僵菌类钙调磷酸酶产孢营养利用抗逆

.蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的克隆及表达分析

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菌物学报 2012年第3期31卷 359-365页

作者：姚秀清金凯夏玉先重庆大学生物工程学院基因工程研究中心、重庆市功能基因及调控技术重点实验室重庆400030

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框(ORF)为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点(pI)... 详细信息

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框(ORF)为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点(pI)为5.53;利用在线软件分析表明,该蛋白既不是分泌型蛋白也不是膜蛋白;同源性比对结果表明,该蛋白与其他真菌中的氰化物水合酶蛋白的同源性较高,具有高度保守的催化三联体特征。用qRT-PCR方法分析了该基因在蝗绿僵菌侵染昆虫过程中的表达情况,结果表明,MaChy在蝗绿僵菌侵染穿透昆虫体壁阶段的表达量最高,约为体内阶段表达量的2.5倍,推测该基因可能在蝗绿僵菌穿透昆虫体壁的过程中起重要作用。

关键词：氰化物水合酶 qRT-PCR 蝗绿僵菌

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蝗绿僵菌烷基硫酸酯酶的功能研究

蝗绿僵菌烷基硫酸酯酶的功能研究

作者：薛晓宁重庆大学

学位级别：硕士

昆虫病原真菌作为重要的生物防治资源,因其具有对人畜安全、对环境友好、害虫不易产生抗性等优点而被广泛关注。大多数丝状真菌都具有两种产孢方式:正常产孢和微循环产孢,相比于正常产孢,微循环产孢产孢快、产孢量大、孢子大小均一,具... 详细信息

昆虫病原真菌作为重要的生物防治资源,因其具有对人畜安全、对环境友好、害虫不易产生抗性等优点而被广泛关注。大多数丝状真菌都具有两种产孢方式:正常产孢和微循环产孢,相比于正常产孢,微循环产孢产孢快、产孢量大、孢子大小均一,具有良好的应用潜力。在实际应用中,外界条件是不可控的,孢子很容易受到外界环境因素如:高温、UV的影响,这些因素对孢子的活力造成影响,从而限制了其作为生物杀虫剂的应用,因此研究调控昆虫病原真菌的产孢、抗逆等重要性状的分子机制,对于真菌杀虫剂研制和生物防治害虫作用重大。前期研究中发现:烷基硫酸酯酶基因(MaAts)在蝗绿僵菌微循环产孢阶段上调表达,生物信息学分析表明:蝗绿僵菌烷基硫酸酯酶MaAts全长1890 bp,编码629个氨基酸,无内含子,蛋白质分子量68.653 KDa,等电点为5.45,无信号肽。通过构建MaAts的敲除菌株(ΔMaAts)和回复菌株(CP)来研究一系列表型变化。发现缺失MaAts后,与WT相比,分生孢子萌发延迟,ΔMaAts的萌发中时(GT)显著增加,MaAts酶活性显著降低。敲除MaAts后蝗绿僵菌的化学物质耐受性和致病能力没有受到影响。ΔMaAts在蝗绿僵菌的微循环产孢培养基(SYA)上的产孢方式发生改变,由微循环产孢转变为正常产孢。此外,ΔMaAts突变体在不同发育阶段的抗紫外、抗湿热能力均下降。比较转录组分析发现,MaAts缺失后差异表达基因共有78个,其中含有已知功能的蛋白58(74%)个,其余20(26%)个为假定蛋白,所有差异表达基因中上调基因56个,下调基因22个,这些差异基因功能大都与调控细胞、膜、膜组分以及代谢过程、细胞过程、应激反应等相关,表明MaAts可能通过影响这些基因的转录水平变化来改变菌株的抗逆性。

关键词：蝗绿僵菌烷基硫酸酯酶产孢方式抗逆能力

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蝗绿僵菌水杨酸代谢在植物抗病性中的作用

蝗绿僵菌水杨酸代谢在植物抗病性中的作用

作者：卢芯重庆大学

学位级别：硕士

蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)作为昆虫病原真菌,在调控有害昆虫种群中起着非常重要的作用。水杨酸属于酚类化合物,是参与激活植物对病原菌免疫反应的信号分子。前期研究发现蝗绿僵菌中含有水杨酸合成酶基因MaSalS,并能产生水杨酸分泌... 详细信息

蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)作为昆虫病原真菌,在调控有害昆虫种群中起着非常重要的作用。水杨酸属于酚类化合物,是参与激活植物对病原菌免疫反应的信号分子。前期研究发现蝗绿僵菌中含有水杨酸合成酶基因MaSalS,并能产生水杨酸分泌到胞外。本论文以蝗绿僵菌野生型、拟南芥(Col-0)及其病原菌丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000,Pst DC3000)为材料,研究了蝗绿僵菌对植物抗病性的影响;以蝗绿僵菌MaSalS敲除菌株(ΔMaSalS)和CP菌株为材料研究了蝗绿僵菌水杨酸代谢在植物抗病性中的作用;通过转录组测序(RNA-seq)研究了蝗绿僵菌及其水杨酸代谢在影响植物抗病性中的作用机制。研究结果对于昆虫病原真菌应用于植物病害具有重要的参考价值,有利于阐明昆虫病原真菌与植物互作的分子机制,可为高效杀虫真菌菌株选育和应用奠定理论基础,对其它真菌与植物互作研究提供新的线索。本论文取得的主要结果如下:(1)体外对峙实验发现蝗绿僵菌不影响拟南芥病原菌Pst DC3000的生长,说明蝗绿僵菌不直接作用于Pst DC3000;扫描电镜观察发现蝗绿僵菌孢子在拟南芥叶片上不萌发,不侵染植物。(2)优化了蝗绿僵菌诱导拟南芥抵抗病原菌Pst DC3000的条件。以不同浓度梯度的野生型蝗绿僵菌菌株Ma102(WT)喷洒3周龄大小的拟南芥幼苗,q RT-PCR检测病原相关基因PR1的表达量,发现Ma102菌株喷洒的最适浓度为5×10个/m L,喷洒量为1 m L/盆(含5棵拟南芥幼苗);不同浓度的Pst DC3000处理拟南芥,根据叶片的感病程度确定Pst DC3000的使用浓度为OD=0.05,喷洒量为1m L/盆;根据不同预处理时间蝗绿僵菌对植物病害的减轻程度情况,发现Ma102与Pst DC3000同时处理拟南芥幼苗时,拟南芥的抗病性最强。(3)蝗绿僵菌可诱导植物产生抗病性。与对照相比,Ma102菌株处理明显减轻了拟南芥感病症状、降级了病级指数、减少了植物体内病原菌Pst DC3000生长量、提高了PR1的表达、促进了拟南芥HO产生。回复菌株处理拟南芥后,其感病程度也明显降低,与WT组一致。可见,蝗绿僵菌Ma102增强了拟南芥对病原菌Pst DC3000的抗性。(4)蝗绿僵菌水杨酸代谢可提高植物抗病性。ΔMaSalS处理拟南芥幼苗后,能够提高拟南芥抗病性,但抗病性明显弱于WT菌株。与WT菌株处理相比,植物各生理指标呈现相似的变化,但变化的幅度明显降低,说明MaSalS敲除明显降低了蝗绿僵菌Ma102在提高拟南芥对病原菌Pst DC3000抗性中的作用。(5)蝗绿僵菌处理可增强植物免疫信号通路基因的表达。RNA-seq分析发现,在6 h时,WT与Pst DC3000处理组筛选到1027个共同差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),GO功能注释和KEGG通路富集分析显示,在功能上,富集到次生代谢产物合成进程(54个)、对细菌的响应(60个)、免疫系统进程(50个)、对水杨酸的响应(29个)上以及具有谷胱甘肽转移酶活性(14个)、氧化还原酶活性(37个)等与植物抗性相关的基因,以及参与芥子油苷生物合成(12个)、苯丙素的生物合成(15个)以及植物MAPK信号通路(13个)等与植物抗性相关的通路基因。表明了蝗绿僵菌能激活拟南芥的抗性相关基因的表达。在12 h时,筛选到157个共同DEGs,但其中富集到植物免疫相关功能的基因减少,但仍有参与植物对细菌的响应的基因11个及免疫应答过程相关基因9个。(6)MaSalS缺失后,蝗绿僵菌激活植物免疫信号通路基因表达的作用减弱。RNA-seq分析发现,在6 h时,MaSalS缺失后,筛选到DEGs 211个,与WT组相比,减少了1179个。GO功能注释和KEGG通路富集分析显示,与WT组相比,富集到同一功能的基因数目减少,如对细菌的响应减少70个,参与免疫系统进程减少59个,对水杨酸的响应减少37个;另外,WT处理组DEGs显著富集到11条通路上,而ΔMaSalS组仅4条,并且同一通路上参与基因数目减少,如富集到芥子油甘合成通路上的DEGs,与WT组相比,减少了10个。综上所述,本研究从生理指标和分子水平上解析了蝗绿僵菌对拟南芥抗病性的影响,分析了蝗绿僵菌通过水杨酸代谢在增强拟南芥抗病性中的作用,并从分子水平揭示了蝗绿僵菌及其水杨酸代谢在影响植物抗病性中的作用机制。生物信息学分析显示:已经测序的其他昆虫病原真菌具有MaSalS的同源基因,所以可能具有相似的水杨酸合成途径。因此,昆虫病原真菌可能普遍具有激活植物抗病性的作用。

关键词：蝗绿僵菌水杨酸合成酶水杨酸植物抗病性 Pst DC3000

蝗绿僵菌氮分解代谢阻遏途径调控蛋白MaNmrA的功能研究

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蝗绿僵菌氮分解代谢阻遏途径调控蛋白MaNmrA的功能研究

作者：张启佩重庆大学

学位级别：硕士

大力发展生物农药是提升农产品质量和维护自然生态环境稳态的重要举措。昆虫病原真菌作为重要的杀虫微生物,具有对环境友好、可持续控制、绿色安全等优点,但杀虫速度慢、生产成本高及易受自然环境影响等不足已成为其田间大规模应用的重... 详细信息

大力发展生物农药是提升农产品质量和维护自然生态环境稳态的重要举措。昆虫病原真菌作为重要的杀虫微生物,具有对环境友好、可持续控制、绿色安全等优点,但杀虫速度慢、生产成本高及易受自然环境影响等不足已成为其田间大规模应用的重要限制因素。因此,阐明昆虫病原真菌生防性状相关基因的作用机制对充分挖掘昆虫病原真菌的生防潜力具有重要理论意义和实际应用价值。营养代谢调控与真菌的生长发育和侵染致病能力有密切联系。已有研究表明,Nmr A是氮分解代谢阻遏(Nitrogen Catabolite Repression,NCR)途径的核心调控蛋白,也是感应碳代谢状态的关键因子,在丝状真菌次级代谢、生长发育和侵染致病过程中发挥着重要作用。目前,昆虫病原真菌中Nmr A的功能未见报道。因此,本文旨在明确模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌中Nmr A的功能。分别构建MaNmrA的敲除突变体和回复菌株用于蝗绿僵菌中MaNmrA的功能分析。本文研究结果如下:1、生物信息学分析显示蝗绿僵菌中的MaNmrA基因编码461个氨基酸。结构域分析显示,MaNmrA蛋白具有NADP结合位点和NADB-Rossmann超家族结构域,该基因在真菌中高度保守。2、MaNmrA缺失后影响蝗绿僵菌产孢特性和孢子萌发。MaNmrA敲除菌株(ΔMaNmrA)产孢延迟、产孢量显著降低、孢子萌发时间显著延迟。3、MaNmrA缺失后影响蝗绿僵菌逆境耐受性。ΔMaNmrA菌株对紫外、湿热耐受性显著降低,对细胞壁破坏剂的敏感性增加,抗氧化和高渗胁迫能力明显降低。4、MaNmrA缺失后影响蝗绿僵菌的营养利用。在添加不同单一氮源培养基上,特别是在添加非偏好性氮源(Na NO和Urea)时,ΔMaNmrA菌株的气生菌丝增多并且更加蓬松密集。在添加不同单一碳源培养基上,ΔMaNmrA菌株的生长速率显著增加,表明ΔMaNmrA菌株的氮源和碳源利用能力均发生改变。5、MaNmrA缺失后影响蝗绿僵菌对雷帕霉素的敏感性。在添加偏好性氮源谷氨酰胺时,ΔMaNmrA菌株对雷帕霉素耐受性显著增加。6、MaNmrA缺失后影响蝗绿僵菌的侵染致病能力。生物测定实验结果表明,无论是体表点滴接种还是注射接种东亚飞蝗,缺失MaNmrA后都会导致蝗绿僵菌的侵染致病能力显著下降。7、MaNmrA的缺失影响了蝗绿僵菌对东亚飞蝗体壁的穿透。ΔMaNmrA菌株在东亚飞蝗后翅上的萌发减慢、附着胞的形成率显著降低。以上结果表明,MaNmrA可能通过调控对环境营养利用来影响蝗绿僵菌的生长发育、抗逆和侵染致病能力。

关键词：蝗绿僵菌氮分解代谢阻遏途径 MaNmrA 毒力逆境耐受性

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蝗绿僵菌转录因子MapacC的功能研究

蝗绿僵菌转录因子MapacC的功能研究

作者：张茂歌重庆大学

学位级别：硕士

昆虫病原真菌作为重要的生防资源,潜力巨大。昆虫病原真菌孢子的产量和质量、逆境耐受性以及毒力是衡量杀虫真菌农药防效的重要指标。已有研究表明,CH型转录因子pacC/Rim101在真菌适应碱性pH环境生长、产孢以及侵染致病过程中起重要作用... 详细信息

昆虫病原真菌作为重要的生防资源,潜力巨大。昆虫病原真菌孢子的产量和质量、逆境耐受性以及毒力是衡量杀虫真菌农药防效的重要指标。已有研究表明,CH型转录因子pacC/Rim101在真菌适应碱性pH环境生长、产孢以及侵染致病过程中起重要作用,且在不同真菌中其功能存在差异。目前pacC在模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌中的功能还未见报道,本研究采用敲除和回复策略明确了转录因子MapacC的功能。研究发现,与其他真菌中的pacC相似,蝗绿僵菌中的pacC蛋白含有3个CH型锌指结构,在蝗绿僵菌适应碱性环境生长过程中起重要作用。表达特征分析结果表明,MapacC在蝗绿僵菌侵入昆虫体内初期的表达量最高,推测该基因可能在蝗绿僵菌适应昆虫体内环境或躲避寄主免疫反应过程中起重要作用。敲除MapacC后蝗绿僵菌产孢量降低,抗紫外能力不变,但一些抵御热休克的基因表达量显著升高导致蝗绿僵菌的耐热性增加。荧光染色分析发现,MapacC缺失后蝗绿僵菌分生孢子表面的结构发生了变化。敲除MapacC后蝗绿僵菌的毒力显著降低。侵染过程分析发现,MapacC缺失后对蝗绿僵菌附着胞的形成影响轻微,但在蝗虫体内增殖速率显著降低,与受到野生型菌株侵染的蝗虫相比,接种了ΔMapacC菌株孢子的蝗虫血液中酚氧化物(PO)酶活显著升高,体壁上结节数量显著增多,说明MapacC可能在蝗绿僵菌躲避蝗虫的免疫识别过程中起重要作用。值得注意的是,敲除MapacC后蝗绿僵菌无法进行微循环产孢,RNA-seq分析共筛选得到差异表达基因44个,其中27个基因在MapacC缺失后上调表达,17个基因下调表达,根据有注释信息的34个基因分析发现,MapacC可能通过调控细胞分裂和菌丝生长等过程中起重要作用的蛋白影响蝗绿僵菌的产孢模式转换。综上所述,本研究明确了MapacC在蝗绿僵菌中的作用,发现该基因对蝗绿僵菌的生防潜能具有重要贡献。本研究结果将为进一步阐明昆虫病原真菌的侵染致病机制和丝状真菌产孢模式转换机制提供理论依据,有望为昆虫病原真菌的分子改良提供新的候选基因,具有重要的理论意义和实际应用价值。

关键词：蝗绿僵菌 MapacC 耐热性毒力微循环产孢

蝗绿僵菌中Asp f2类蛋白MaAL的功能研究

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蝗绿僵菌中Asp f2类蛋白MaAL的功能研究

作者：金玉梅重庆大学

学位级别：硕士

昆虫病原真菌作为重要的杀虫微生物,具有对环境友好、对人畜无害、可持续控制等优点,但同时杀虫速度慢、生产成本高、防效不稳定和易受环境因素影响等不足成为了其田间实际使用的重要限制因素。因此,对于与昆虫病原真菌生防性状相关基... 详细信息

昆虫病原真菌作为重要的杀虫微生物,具有对环境友好、对人畜无害、可持续控制等优点,但同时杀虫速度慢、生产成本高、防效不稳定和易受环境因素影响等不足成为了其田间实际使用的重要限制因素。因此,对于与昆虫病原真菌生防性状相关基因的研究具有十分重要的理论意义与实际应用价值。研究发现,Asp f2是烟曲霉的Ⅱ类变应原,与多种过敏性疾病相关。在丝状真菌中研究发现,其同源蛋白在生长发育与侵染致病过程中发挥了重要作用。目前,在昆虫病原真菌中,对其同源蛋白的功能还未见报道。因此本文旨在明确Asp f2的同源蛋白MaAL(Metarhizium acdrium Asp f2-like)在模式昆虫病原真菌蝗绿僵菌中的功能。通过对其生物信息学分析后,构建了MaAL的敲除菌株(ΔMaAL)、回复(CP)菌株用于蝗绿僵菌中MaAL的功能研究。得到了以下结果:1.MaAL突变后影响蝗绿僵菌的孢子萌发与产孢量。MaAL敲除菌株中,孢子萌发速率提高,产孢量显著提高;2.MaAL突变后影响菌株的逆境耐受性。ΔMaAL对于紫外、湿热和高渗环境的耐受性显著提高;3.MaAL突变后影响了菌株的致病力。生物测定实验表明,无论是体表点滴接种还是体内注射接种东亚飞蝗,ΔMaAL都显著提高了蝗绿僵菌的毒力;4.MaAL突变后影响了蝗绿僵菌在蝗虫体内的生长过程。ΔMaAL在蝗虫血腔中提前形成且生长加快。5.MaAL突变后影响了蝗绿僵菌对东亚飞蝗体壁的穿透。ΔMaAL在蝗虫后翅形成的附着胞膨压升高,与体壁穿透相关的部分蛋白酶基因和几丁质酶基因表达量显著升高;6.MaAL可能参与了寄主对真菌的免疫反应。ΔMaAL处理蝗虫后,Toll通路中免疫相关基因的表达量显著下降。蝗虫血淋巴中酚氧化物酶酶活显著降低;7.对21 h的附着胞样品进行RNA-seq数据分析,定义差异倍数(|log|)≥2以及FDR≤0.05时,差异表达基因268个。对有注释的基因功能分析后,MaAL可能调控与生长发育、代谢、免疫等相关基因的表达进一步调控毒力。综上所述,本研究通过对MaAL的功能研究,发现MaAL参与调控蝗绿僵菌孢子萌发和产孢量,并且敲除该基因后的菌株对紫外和湿热等的逆境耐受性增强、致病性增强。为进一步阐明MaAL影响蝗绿僵菌生长、抗逆性及毒力的机制奠定基础。

关键词：蝗绿僵菌 MaAL 致病性产孢量逆境耐受性