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早孕期母-胎界面蜕膜基质细胞过表达肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82导致妊娠失败

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复旦学报（医学版） 2011年第5期38卷 382-388页

作者：邵珺李明清沈宗姬李大金复旦大学附属妇产科医院-妇产科研究所上海200011 苏州大学附属第一医院妇产科江苏苏州215123

目的观察肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达情况,并建立蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)与滋养细胞共培养模型,探讨KAI1/CD82在人母-胎界面的生物学作用。方法分别采用RT-PCR和Real-time PCR、免疫... 详细信息

目的观察肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达情况,并建立蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)与滋养细胞共培养模型,探讨KAI1/CD82在人母-胎界面的生物学作用。方法分别采用RT-PCR和Real-time PCR、免疫组化和Western blot技术分析KAI1/CD82在人早孕期正常妊娠和自然流产的绒毛和蜕膜组织中的转录及翻译水平。模拟体内微环境,建立了DSC和滋养细胞BeWo细胞株共培养体系,利用RNA干扰沉默DSC细胞KAI1/CD82表达,探讨DSC是否通过表达KAI1/CD82对滋养细胞侵袭性发挥调节作用。结果自然流产母-胎界面KAI1/CD82转录水平明显高于正常妊娠(P蜕膜组织KAI1/CD82蛋白表达也明显高于正常妊娠(P细胞不表达KAI1/CD82蛋白。采用RNA干扰技术成功沉默DSC细胞KAI1/CD82表达;KAI1/CD82基因沉默后,与DSC细胞共培养的BeWo细胞侵袭力显著增强。结论 DSC通过表达KAI1/CD82控制滋养细胞的侵袭,而一旦DSC异常过表达KAI1/CD82将导致滋养细胞侵袭力异常降低,最终可能导致自然流产的发生。

关键词： KAI1/CD82基因蜕膜基质细胞滋养细胞侵袭力自然流产

IL-10、IFN-γ调控早孕蜕膜基质细胞活性IL-10受体表达

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分子细胞生物学报 2006年第2期39卷 111-117页

作者：邢长英归绥琪复旦大学附属妇产科医院上海200011

研究IL-10、IFN-γ对人早孕蜕膜基质细胞活性及IL-10受体表达的影响。MTT法检测蜕膜基质细胞活性,选择两种不同作用浓度的IL-10、IFN-γ作用蜕膜基质细胞,处理15min、30min、45min、60min分别检测组胞IL-10受体R1、R2基因表达。高浓度IL... 详细信息

研究IL-10、IFN-γ对人早孕蜕膜基质细胞活性及IL-10受体表达的影响。MTT法检测蜕膜基质细胞活性,选择两种不同作用浓度的IL-10、IFN-γ作用蜕膜基质细胞,处理15min、30min、45min、60min分别检测组胞IL-10受体R1、R2基因表达。高浓度IL-10(10-100ng/ml)促进蜕膜基质细胞活性(P＜0．05),低浓度IL-10(0．10-lng/ml)则无明显促进作用(P＞0．05)；高浓度IFN-γ(1000ng/ml)抑制蜕膜基质细胞活性(P＜0．01),低浓度IFN-γ(10ng/ml)反而起促进作用(P＜0．05)。较高浓度IL-10(10ng/ml)作用15min即见IL-10R1高表达,30min明显减弱,45min表达消失；较低浓度IL-10(lng/ml)作用60min内未见IL-10R1表达。IFN-γ(100ng/ml)作用45min见IL-10R1短暂低表达：较低浓度IFN-γ(10ng/ml)作用30min诱导IL-10R1中表达,45min表达减弱,60min消失。上述细胞因子作用前后IL-10R2表达差异无显著性(P＞0．05)。因此,我们认为,早孕IL-10、IFN-γ可能通过影响蜕膜基质细胞IL-10R1表达及细胞活性,发挥免疫调节作用。

关键词： IL-10 IFN-γ 蜕膜基质细胞 IL-10受体

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

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南方医科大学学报 2006年第7期26卷 914-917页

作者：秦立赟陈士岭张曦倩王炎秋南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心广东广州510515

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为。方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transw... 详细信息

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为。方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度。结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持。上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04。结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制。

关键词：绒毛外细胞滋养层细胞蜕膜基质细胞共培养侵袭 Transwell

蜕膜基质细胞IER3通过调控NF-κB通路参与分娩启动

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蜕膜基质细胞IER3通过调控NF-κB通路参与分娩启动

作者：刘莉娟中南大学

学位级别：硕士

研究目的:研究蜕膜基质细胞(decidual stromal cells,DSCs)中即刻早期反应蛋白3(Immediate early response 3,IER3)的表达水平及其信号通路,揭示其参与分娩启动的作用及作用机制。研究方法:(1)通过临产前后蜕膜单细胞转录组测序以及生... 详细信息

研究目的:研究蜕膜基质细胞(decidual stromal cells,DSCs)中即刻早期反应蛋白3(Immediate early response 3,IER3)的表达水平及其信号通路,揭示其参与分娩启动的作用及作用机制。研究方法:(1)通过临产前后蜕膜单细胞转录组测序以及生信分析,对蜕膜层面不同细胞分群和相关基因表达改变进行分析。(2)收集足月临产(term in labor,TL组)和足月未临产(term not in labor,TNL组)产妇的蜕膜,联合正常以及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)炎症孕鼠模型,利用RT-q PCR、Western Blot、免疫组化以及免疫荧光等技术,对临产后DSCs中表达上调分子IER3、NF-κB通路关键分子iκB和P65以及下游靶基因(如IL-1、IL-6、IL-8、CCL2、CCL4等)表达水平进行体内验证。(3)提取人原代DSCs并进行体外培养,结合NF-κB通路激动剂和抑制剂干预以及si-IER3转染,分析上述因素处理后DSCs中IER3、NF-κB通路关键分子iκB和P65表达水平及调控。同时提取人原代子宫平滑肌细胞,与CD14(+)磁珠分选获得单核细胞进行共培养,通过ELISA、鬼笔环肽荧光染色等技术,分析DSCs中下游靶基因(如IL-1、IL-6、IL-8、CCL2、CCL4等)表达水平以及单核细胞趋化能力和子宫平滑肌细胞收缩改变。(4)使用Graphpad Prism对实验结果进行统计分析,两组之间计量资料数据比较使用Student’s t检验,多组之间使用单因素方差分析,计数资料使用卡方检验,P蜕膜单细胞转录组测序结果:IER3在临产后DSCs中表达明显上调(P细胞中的表达也均有不同程度的增加。进一步对DSCs临产后上调基因进行KEGG富集分析,结果显示炎症免疫相关通路均有富集,其中NF-κB通路排序靠前。(2)足月蜕膜IER3定位以及表达结果:IER3主要定位于DSCs。IER3 m RNA及蛋白表达水平在临产后明显高于临产前(P细胞免疫荧光定位结果显示,IER3主要分布在胞核。IER3表达水平呈LPS浓度和时间依赖性,其m RNA和蛋白水平在LPS 100ng/ml、3h和6h干预下达高峰。NF-κB通路关键分子iκB和P65磷酸化水平同步上升,相关性分析显示其相关系数分别为0.92(P=0.0268),0.96(P=0.01)。在NF-κB通路抑制剂PDTC 20μM,48h干预下,IER3与iκB和P65磷酸化水平同步下调,其相关系数分别为0.92(P=0.0266),0.98(P=0.0039)。2)DSCs中IER3敲减对NF-κB通路分子的影响:敲减IER3导致NF-κB通路关键分子iκB和P65磷酸化水平下调,其中IER3敲减效率为60%,同时P65磷酸化水平下调达40%,iκB磷酸化水平下调达30%,且P65入核激活下调达91%(P细胞迁移和平滑肌细胞收缩的影响:LPS处理DSCs后的细胞上清与单核细胞共培养,结果显示LPS处理后的细胞上清可显著促进单核细胞趋化,而敲减IER3的细胞上清处理后单核细胞趋化能力降低37%左右(P细胞上清与平滑肌细胞共培养,结果显示平滑肌细胞收缩增加,而敲减IER3后,其收缩受到抑制(P蜕膜基质细胞中IER3表达水平受NF-κB通路调控,且IER3可通过正向调控P65激发下游炎症和趋化因子表达的级联上调,进

关键词： IER3 蜕膜基质细胞 NF-κB通路分娩发动炎症免疫

蜕膜基质细胞中OPN介导炎症反应参与早产的机制研究

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蜕膜基质细胞中OPN介导炎症反应参与早产的机制研究

作者：张潇文中南大学

学位级别：硕士

目的:通过对骨桥蛋白(OPN)在早产患者蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)中的表达变化及其相关作用通路的探讨,揭示其在早产中的作用及作用机制。方法:通过足月临产前后蜕膜单细胞转录组测序,分析临产前后DSC中显著变化的通路,并... 详细信息

目的:通过对骨桥蛋白(OPN)在早产患者蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)中的表达变化及其相关作用通路的探讨,揭示其在早产中的作用及作用机制。方法:通过足月临产前后蜕膜单细胞转录组测序,分析临产前后DSC中显著变化的通路,并筛选出分娩发动后DSC内显著上调的分子OPN,及显著上调的炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、CCL2、CCL5,进而应用免疫荧光、免疫组化、Western Blot法在早产临产(PTL组)、足月临产(TL组)和早产未临产(PTNL组)产妇蜕膜中进行验证,同时应用Western Blot法检测各组蜕膜中磷酸化p65水平,并通过q RT-PCR法检测蜕膜组织中OPN、IL-1、IL-6、IL-8、CCL2、CCL5的表达水平。进一步构建人原代DSC模型,联合使用不同剂量和作用时间的LPS干预实验、小干扰RNA敲降实验,以及与CD14外周血单核细胞共培养实验,通过ELISA法检测DSC上清中IL-1、IL-6、TNFα、IL-8、CCL2、CCL4、CCL5、CCL7的浓度,并比较DSC中磷酸化p65、磷酸化IκBα水平以及p65入核比例;同时利用Transwell实验检测单核细胞迁移能力的变化,以及rh CCL5和CCL5受体拮抗剂(Maraviroc)对单核细胞迁移能力的影响。结果:(1)足月临产前后蜕膜单细胞转录组测序及通路富集结果:相比于未临产组,足月临产组DSC中细胞因子与细胞因子互作通路、趋化因子通路等炎症相关通路显著上调;足月临产后的DSC中OPN上调2.5倍,差异存在显著统计学意义,且炎症因子IL-1、IL-6、IL-8和趋化因子CCL2、CCL5也显著上调。(2)早产蜕膜中OPN的定位及表达:早产蜕膜中OPN主要定位在DSC内。通过免疫组化及Western Blot法,对PTL组、TL组、PTNL组DSC内及蜕膜组织中OPN的表达进行半定量分析,DSC内及蜕膜中OPN表达量分别为:7.96±0.22、5.68±0.34、2.90±0.34和2.26±0.09、1.13±0.07、0.85±0.03,结果表明PTL组OPN蛋白水平显著高于TL组及PTNL组(P蜕膜中OPN相关通路指标的变化:PTL组蜕膜中p65磷酸化活性以及下游炎症因子IL-1、IL-6、IL-8和趋化因子CCL2、CCL5的m RNA水平显著高于TL组和PTNL组(P细胞模型中OPN及其相关通路的调节:a)OPN定位在DSC胞浆和胞核中,其m RNA、蛋白水平呈剂量和时间依赖性方式受LPS调节(P细胞趋化因子CCL5表达下调最显著(P细胞迁移能力的影响:LPS处理后共培养体系中单核细胞的趋化能力增强(P细胞趋化(P细胞的趋化能力降低(P蜕膜炎症反应,借助炎症因子和趋化因子,诱导外周血单核细胞趋化,参与早产的发生。图12幅,表14个,参考文献83篇

关键词： OPN 蜕膜基质细胞早产炎症反应外周血单核细胞 NF-κB

孕激素对早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ受体基因表达的调控

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华西医科大学学报 2002年第2期33卷 183-185,188页

作者：李尚为李蕾曹泽毅彭芝兰韩字研杨业洲四川大学华西第二医院妇产科成都610041

目的　探讨孕激素对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子 - 受体 (IGF- R)基因表达的影响。方法　采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测不同浓度孕激素作用 72小时后及 0 .1μm ol/ L孕激素作用不同时间后人... 详细信息

目的　探讨孕激素对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子 - 受体 (IGF- R)基因表达的影响。方法　采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术半定量检测不同浓度孕激素作用 72小时后及 0 .1μm ol/ L孕激素作用不同时间后人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA的表达水平。结果　体外培养的人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA呈强阳性表达 ,孕激素降调 IGF- R m RNA的表达 ,并与浓度呈显著负相关 (r=- 0 .6 80 ,P0 .0 5 )。结论　孕激素可能通过降调人早孕蜕膜基质细胞中 IGF- R m RNA的表达 ,调节基质细胞的增殖和蜕膜化。

关键词：孕激素早孕蜕膜基质细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ受体基因表达基因调控体外培养

人早孕蜕膜基质细胞及免疫活性细胞趋化因子受体CXCR6的表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第4期26卷 298-302页

作者：黄煜李大金复旦大学上海医学院附属妇产科医院暨妇产科研究所生殖免疫室上海200011

目的分析人早孕期蜕膜基质细胞趋化因子配基受体对CXCL16／CXCR6的表达及免疫活性细胞趋化因子受体CXCR6的表达,以探讨CXCL16／CXCR6在蜕膜免疫活性细胞募集中的可能规律。方法收集早孕期蜕膜组织,分离蜕膜基质细胞和免疫细胞,分别采用... 详细信息

目的分析人早孕期蜕膜基质细胞趋化因子配基受体对CXCL16／CXCR6的表达及免疫活性细胞趋化因子受体CXCR6的表达,以探讨CXCL16／CXCR6在蜕膜免疫活性细胞募集中的可能规律。方法收集早孕期蜕膜组织,分离蜕膜基质细胞和免疫细胞,分别采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术分析蜕膜基质细胞CXCL16和CXCR6的表达;流式细胞术分析蜕膜CD56^+CD16^- NK细胞、CD56^+CD16^+NK细胞、NKT细胞、T细胞、γδT细胞、单核细胞CXCR6的表达。结果人早孕蜕膜基质细胞高水平转录趋化因子受体CXCR6,低水平转录其配体CXCL16,但CXCL16和CXCR6在蛋白水平的表达偏低。早孕蜕膜γδT细胞CXCR6阳性率为87．29％;CD14^+单核细胞CXCR6阳性率为47．71％;NKT细胞CXCR6阳性率为44．14％;T细胞CXCR6表达率为32．91％;而蜕膜两种NK细胞 (CD56^+CD16^-、CD56^+CD16^+)几乎不表达CXCR6,,结论人γδT细胞、单核细胞、NKT细胞、T细胞可能通过表达趋化因子受体CXCR6被募集到蜕膜局部并驻留,从而参与早孕期母胎界面的免疫调节。

关键词：蜕膜基质细胞蜕膜白细胞 CXCR6 趋化因子

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小鼠子宫蜕膜基质细胞的分离培养

中国组织工程研究与临床康复 2008年第25期12卷 4887-4890页

作者：徐英萍王家富李伟宋文刚泰山医学院山东省泰安市271000

目的：蜕膜组织的细胞成分相当复杂，其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75％，其能分泌多种细胞因子，既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境。实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法，为进一步建立蜕膜细胞... 详细信息

目的：蜕膜组织的细胞成分相当复杂，其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75％，其能分泌多种细胞因子，既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境。实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法，为进一步建立蜕膜细胞共培养系统将为研究病理性妊娠打下良好的基础。方法：实验于2006—09／2008-01在泰山医学院实验动物中心，SPF级实验室完成。①实验材料：8～10周龄C57BL／6雌性小鼠，由北京维通力化实验动物技术有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选用孕龄6～8d的C57BL／6小鼠蜕膜组织进行体外培养，采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化，进行全组分蜕膜细胞培养，采用原代细胞过夜换液方法清除红细胞、淋巴细胞和不贴壁的细胞成分，利用传3代方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。纯化后，观察蜕膜基质细胞的生长变化规律，制作细胞爬片，用催乳素免疫组织化学试剂盒检测培养细胞的成分。结果：①小鼠蜕膜基质细胞在接种24h后大部分已贴壁，贴壁生长的细胞成纤维母细胞状，一般培养5～7d后细胞融合成单层。原代培养的蜕膜基质细胞在含10％胎牛血清的培养液中可增生数周，四五天传代1次，传代后的细胞形态无明显变化，而传代培养极性渐不明显。②免疫组织化学显示，体外培养传代后95％阳性细胞为蜕膜基质细胞，细胞大小形状基本均一，染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒，且越近胞核染色越深。结论：采用复合酶消化，换液传代方法提纯蜕膜组织，方法简单、经济实用，并可获得较高纯度的蜕膜基质细胞。

关键词：蜕膜基质细胞复合消化酶体外培养免疫组织化学

人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞的分离培养方法

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武汉大学学报（医学版） 2012年第2期33卷 195-198页

作者：刘永巧任亮周雯慧张元珍武汉大学中南医院生殖医学中心/妇产科湖北武汉430071

目的:建立一种经济、高效的人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞分离、培养方法。方法:胶原酶、胰酶联合消化蜕膜组织,网筛过滤、密度梯度离心及差速贴壁法纯化细胞;免疫细胞化学法鉴定细胞纯度;MTT增殖实验分析细胞体外增殖活力。结... 详细信息

目的:建立一种经济、高效的人早孕期蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞分离、培养方法。方法:胶原酶、胰酶联合消化蜕膜组织,网筛过滤、密度梯度离心及差速贴壁法纯化细胞;免疫细胞化学法鉴定细胞纯度;MTT增殖实验分析细胞体外增殖活力。结果:利用此法可成功体外培养蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞,细胞纯度可达90%以上,并在体外呈现良好的生长状态。结论:此法经济、高效,能够同时获得纯度较高的蜕膜基质细胞及蜕膜腺上皮细胞。

关键词：蜕膜基质细胞蜕膜腺上皮细胞体外培养