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人血浆蛋白c浓缩物的研制

人血浆蛋白C浓缩物的研制

作者：王宗奎北京协和医学院

学位级别：硕士

目的探索建立一种串联离子交换层析和固定化金属螯合亲和层析从cohn氏法组份Ⅳ分离纯化蛋白c的方法,降低纯化蛋白c的成本,并实现血浆的综合利用。方法4℃条件下,cohn氏法组份Ⅳ用磷酸盐缓冲液按1：10(w/v)的比例搅拌抽提5h,离心(6500g,4... 详细信息

目的探索建立一种串联离子交换层析和固定化金属螯合亲和层析从cohn氏法组份Ⅳ分离纯化蛋白c的方法,降低纯化蛋白c的成本,并实现血浆的综合利用。方法4℃条件下,cohn氏法组份Ⅳ用磷酸盐缓冲液按1：10(w/v)的比例搅拌抽提5h,离心(6500g,4℃) 40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤,按1：10(w/w)比例加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,缓慢搅拌.6h(24℃)。超滤透析后,再通过串联离子交换层析和固定化金属螯合亲和层析,对蛋白c进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白c的纯度;通过Western Blot鉴定蛋白c的特异性;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO国际标准指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白c活性。结果在有机溶剂/去污剂病毒灭活过程中,0.1mol/L的组氨酸和2.5%的人血清白蛋白能使蛋白c的活性保持在85%以上。纯化的蛋白c在SDS-PAGE图谱上呈现一条62kD左右的蛋白带,Western Blot检测显阳性。经过离子交换层析,蛋白c的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固定化金属螯合亲和层析后,蛋白c活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;经过两步层析后,蛋白c总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg.结论组氨酸和人血清白蛋白可以作为有机溶剂／去污剂灭活脂包膜病毒过程中蛋白c的一种很有效的保护剂。串联离子交换层析和固定化金属螯合亲和层析可以从cohn氏法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白c浓缩物,能显著降低成本,实现血浆的综合利用。

关键词： cohn氏法组份Ⅳ 蛋白c 固定化金属螯合亲和层析廉价

导管射频消融术对凝血的影响——D-二聚体、GMP-140、蛋白c、蛋白S检测意义

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导管射频消融术对凝血的影响——D-二聚体、GMP-140、蛋白C、蛋白...

作者：张印明山东大学

学位级别：硕士

目的:射频消融(RFcA)术后出现的血栓并发症日益受到人们的重视,有关血栓栓塞并发症形成的机理,至今尚未阐明,射频损伤是否具有血栓源性,多年来一直是个有争议的问题。讫今为止,很少有人对此做系统研究,更少见长期随访的系统研究。D-二聚... 详细信息

目的:射频消融(RFcA)术后出现的血栓并发症日益受到人们的重视,有关血栓栓塞并发症形成的机理,至今尚未阐明,射频损伤是否具有血栓源性,多年来一直是个有争议的问题。讫今为止,很少有人对此做系统研究,更少见长期随访的系统研究。D-二聚体(DD)和血小板α颗粒膜糖蛋白(GMP-140)是目前最具特异性的反映凝血酶激活及血小板活化,标志血液高凝状态或血栓前状态的分子标志物,因此,对RFcA的患者在术中术后2月检测血液中DD及GMP-140浓度定量检测和分析,可帮助我们观察RFcA术中术后血凝状态的改变,本文旨在通过对RFcA术中术后DD浓度及GMP-140系列检测临床意义的探讨,同时对蛋白c、蛋白S进行检测,来研究RFcA对血凝状态的影响。方法:连续入选自2006年10月至2007年6月31名接受RFcA治疗的快速性心律失常病人进入实验组(男13例,女18例---避开月经期,平均年龄42±16岁,从17～71岁,平均放电次数5.3±3.4次),其中房室旁路12例(右侧旁路4例,左侧8例),房室结折返性心动过速15例,房性心动过速2例,左、右侧室性心动过速各1例。所有患者均无血栓栓塞及出血性疾病病史,其肝、肾功能、血小板计数、凝血相均在正常范围内,术前无服用影响凝血药物史,术后均予阿司匹林0.1qd至三个月。术前均停用抗心律失常药物5个半衰期以上。左心导管者术前经血管鞘注射肝素钠2000u,右心导管者一般不注射肝素钠。采用自身对照方法进行统计学处理。分别于术前、电生理检查(EPS)后即刻、RFcA后即刻及术后24h、3d、7d、1月、2月7个时段抽取静脉血。鞘管内采血时先抽取4ml弃之不用,再取4ml。采用ELISA法测定:GMP-140用2%二乙胺四乙酸(EDTA)抗凝管,DD用109mmol/L的枸橼酸钠抗凝管,均按9:1比例混合:免疫火箭电泳法测定:蛋白c(Pc)缓冲液配制10g/l的琼脂糖溶液,蛋白S用109mmol/l枸橼酸钠抗凝管,3000转离心5分钟取上层血浆,-86℃保存,做蛋白c、蛋白S、GMP-140、DD检测。结果 1.平均血浆DD浓度(ug/l)水平:在电生理标测后,由基线值(370±75)上升至(803±138,P＜0.001),放电后其值明显增高至基线值的3倍以上(987±125P＜0.001),术后24h及术后3d DD仍高于术前水平,术后7d较穿刺前水平稍高(410±72,P＞0.05),术后1月恢复穿刺前水平(368±79,P＞0.05)。 ***-140浓度(ug/ml)的动态改变:在电生理标测后,由基线值(11.98±1.78)上升至(15.90±1.53,P＜0.005),放电后,其值再度增高至基线值的2倍(21.60±2.11 P＜0.001),然而与DD浓度变化不同的是,术后24h～3d,GMP-140仍继续增高至(1480±1 65,P＜0.001),为基线值的3倍多,术后7d较穿刺前水平稍高(15.20±2.10,P＞0.05),术后1月恢复穿刺前水平(12.18±1.89,P＞0.05)。 ***-140、DD与RFcA程序变量的相关性分析:GMP-140、DD浓度变化与放电时间、X线暴光时间、累积放电能量及手术持续时间无相关性(P＞0.05),性别因素对测定值无影响. 4.术中应用肝素对血小板活化不产生影响,然而应用肝素组,在放电后及术后3d～7d,血浆DD浓度上升幅度明显较非肝素组低(分别:P＜0.05,P＜0.002)。 5.蛋白c、蛋白S:检测术中术后没见明显变化(P＞0.05)。结论: 1.射频消融术中术后血浆DD浓度增高,持续7d以上。 ***术可导致患者血液中的DD升高,多为一过性,持续性增高往往提示血栓疾病的发生。 ***术中术后GMP-140浓度增加,持续时间较DD较长。 ***和RFcA术可引起血小板活化、纤溶系统激活,血凝状态改变,致血栓形成。 5.肝素对RFcA术后DD浓度增高有一定抑制作用,但还不足以对RFcA所致的血凝状态改变产生保护作用,临床需进一步研究,寻找更好的抗凝及抗血小板活化药物,以减少RFcA术后潜在的血栓危险性。 ***和RFcA术对蛋白c、蛋白S没有影响。

关键词：导管射频消融术血小板a-颗粒膜糖蛋白 D-二聚体蛋白c 蛋白S

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低蛋白c和蛋白S新生儿脑梗死1例报道

中国当代儿科杂志 2012年第10期14卷 798-799页

作者：王子威崔红首都医科大学附属北京友谊医院儿科北京100050

患儿,男,62 d,因间断抽搐55 d入院。系第1胎第1产,孕38＋2周,顺产娩出,羊水Ⅲ°,出生体重2900 g,生后Apgar评分不详。生后50 h出现嗜睡、反应差,生后68 h左右出现持续性口周青紫、呼吸浅,生后第7天开始出现反复抽搐,表现为双眼上翻,伴... 详细信息

患儿,男,62 d,因间断抽搐55 d入院。系第1胎第1产,孕38＋2周,顺产娩出,羊水Ⅲ°,出生体重2900 g,生后Apgar评分不详。生后50 h出现嗜睡、反应差,生后68 h左右出现持续性口周青紫、呼吸浅,生后第7天开始出现反复抽搐,表现为双眼上翻,伴口周发绀,四肢节律性抖动,

关键词：脑梗死新生儿蛋白S 蛋白c Apgar评分间断抽搐出生体重反复抽搐

高压电烧伤对SD大鼠血栓调节蛋白、蛋白c、蛋白S及D二聚体的早期影响

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实用医学杂志 2016年第1期32卷 37-40页

作者：刘泽世呼瑞刘二军周谨西安交通大学医学院第二附属医院检验科 710003 陕西省西北妇女儿童医院西安市710003 河北医科大学第一医院石家庄市050031

目的:探讨高压电烧伤对SD大鼠外周血血栓调节蛋白(thronlbonlodulin,TM)、蛋白c(protein c,Pc)、蛋白S(protein S,PS)及D二聚体(D-Dimer,D-D)的影响。方法:将120只SD大鼠按随机数字表法分为假高压电烧伤组(简称假伤组)、高压电烧伤组(... 详细信息

目的:探讨高压电烧伤对SD大鼠外周血血栓调节蛋白(thronlbonlodulin,TM)、蛋白c(protein c,Pc)、蛋白S(protein S,PS)及D二聚体(D-Dimer,D-D)的影响。方法:将120只SD大鼠按随机数字表法分为假高压电烧伤组(简称假伤组)、高压电烧伤组(简称电伤组),每组60只。2组致伤前15 min按随机数字表法各取10只大鼠,心脏采血分离血浆。电伤组余下50只大鼠用调压器和实验变压器造成高压电烧伤,假伤组余下50只大鼠按相同装置不通电模拟致伤。伤后5 min和1、2、4、8 h,每组SD大鼠按随机数字表法各取10只大鼠,心脏采血分离血浆。测定各时相点血清中TM、Pc、PS及血浆中D-D的变化。对数据行析因设计方差分析、LSD检验。结果:电伤组SD大鼠的TM浓度在伤后5 min至8 h明显高于假伤组(均P0.05)外,电伤组大鼠其余各时相点Pc、PS浓度均低于假伤组(均Pc、PS的浓度降低,血管内皮细胞的完整性被破坏,凝血功能受到严重影响。

关键词：高压电烧伤血栓调节蛋白蛋白c 蛋白S D二聚体

凝血酶-抗凝血酶、蛋白c联合检测在急性呼吸窘迫综合征中的应用

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军医进修学院学报 2008年第2期29卷 155-156页

作者：高志国邢台市人民医院呼吸科河北054000

目前对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的诊断重点已从明显或典型转为不明显的前期ARDS，而多数常规实验室诊断指标凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、血小板计数无明显改变,但蛋白c(protein c,Pc)明显... 详细信息

目前对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的诊断重点已从明显或典型转为不明显的前期ARDS，而多数常规实验室诊断指标凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、血小板计数无明显改变,但蛋白c(protein c,Pc)明显降低,D-二聚体(D-D)、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)、纤溶酶-抗纤溶酶复合物(plasmin-α2-antiplasmin,PAP)等明显升高.

关键词：呼吸窘迫综合征成人 D-二聚体凝血酶-抗凝血酶复合物纤溶酶-抗纤溶酶复合物蛋白c

同型半胱氨酸对实验性结肠炎大鼠血栓调节蛋白和内皮细胞蛋白c受体表达的影响

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安徽医科大学学报 2016年第11期51卷 1621-1624页

作者：陈义丁少桢梅俏刘晓昌胡静韩玮许建明安徽医科大学第一附属医院消化内科合肥230022

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对实验性结肠炎大鼠结肠黏膜中可溶性血栓调节蛋白(s TM)、蛋白c(Pc)、游离蛋白S(f PS)水平及血栓调节蛋白(TM)、内皮细胞蛋白c受体(EPcR)mRNA表达的影响。方法 SD大鼠分为正常组:组1[生理盐水(NS)皮下注射+N... 详细信息

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对实验性结肠炎大鼠结肠黏膜中可溶性血栓调节蛋白(s TM)、蛋白c(Pc)、游离蛋白S(f PS)水平及血栓调节蛋白(TM)、内皮细胞蛋白c受体(EPcR)mRNA表达的影响。方法 SD大鼠分为正常组:组1[生理盐水(NS)皮下注射+NS灌肠]、组2(Hcy皮下注射+NS灌肠);TNBS模型组:组1(NS皮下注射+TNBS灌肠)、组2(Hcy皮下注射+TNBS灌肠)。实验结束时采用ELISA法检测大鼠结肠黏膜中s TM、f PS、Pc水平,采用RTq PcR法检测大鼠结肠黏膜中TM、EPcR mRNA的表达水平。结果与TNBS模型组1相比,TNBS模型组2大鼠血浆及结肠Hcy水平均显著增高,大鼠结肠黏膜中s TM、Pc和f PS水平降低(PcR mRNA表达水平降低(Pcy可以加重大鼠结肠炎症损伤,其机制可能是影响Pc的抗炎与抗凝功能,引起肠道微循环血栓前状态。

关键词：同型半胱氨酸可溶性血栓调节蛋白蛋白c 游离蛋白S 内皮细胞蛋白c受体

乌司他丁对重度脓毒症诱导的ALI/ARDS大鼠肺组织蛋白c含量及活化的影响

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乌司他丁对重度脓毒症诱导的ALI/ARDS大鼠肺组织蛋白C含量及活化...

作者：王璐复旦大学

学位级别：硕士

目的探讨乌司他丁对重度脓毒症诱导的ALI/ARDS肺组织蛋白c含量及活化的影响。方法应用盲肠结扎穿孔加生理盐水灌洗法制作重度脓毒症诱导的ALI/ARDS大鼠,以PaO2/FiO2≤300作为ALI/ARDS大鼠纳入标准,随机分为ALI/ARDS组、乌司他丁5万单位... 详细信息

目的探讨乌司他丁对重度脓毒症诱导的ALI/ARDS肺组织蛋白c含量及活化的影响。方法应用盲肠结扎穿孔加生理盐水灌洗法制作重度脓毒症诱导的ALI/ARDS大鼠,以PaO2/FiO2≤300作为ALI/ARDS大鼠纳入标准,随机分为ALI/ARDS组、乌司他丁5万单位/Kg组、乌司他丁10单位/Kg组。成模后1h、2h、3h处死大鼠,取肺组织称重制备组织匀浆,ELISA方法测定其蛋白c(Pc)及活化蛋白c(APc)浓度。结果(1)各时点肺组织Pc含量：乌司他丁10万单位/Kg组[(3431±793),(3945±661),(4370±306)ng/ml],低于乌司他丁5万单位/Kg组[(3826±355),(4697±389),(5289±587)ng/m1],差异元统计学意义(p>0.05),二者均低于ALI/ARDS组[(4324±424),(5788±409),(6008±317)ng/ml],差异均有显著统计学意义(pc的含量：乌司他丁10万单位/Kg组[(1341±213),(1900±338),(1802±376)ng/ml]低于乌司他丁5万单位/Kg组[(1593±385),(2022±193),(1987±411)ng/ml],差异无统计学意义(p>0.05),二者均低于ALI/ARDS组[(3945±270),(3618±352),(2968±407)ng/ml],差异均有统计学意义(p0.05)结论乌司他丁降低重度脓毒症诱导的ALI/ARDS肺组织Pc的含量,并呈剂量依赖趋势,但乌司他丁呈现对Pc活化有保护作用。

关键词：乌司他丁重度脓毒症 ALI/ARDS 蛋白c 活化蛋白c

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人血浆蛋白c的分离纯化与鉴定

生物化学杂志 1993年第2期9卷 204-207页

作者：王博诚李金泉金坚张满达江苏省原子医学研究所无锡214063

冰冻人血浆37℃融化后,经钡盐吸附沉淀、硫酸铵分步盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、制备性PAGE和肝素亲和层析分离,得到蛋白c。经鉴定,所得蛋白c分子量约为62kD,pI为4.69,PAGE分析高度均一,KPTT法证实其延长凝血时间,与有关文献报道... 详细信息

冰冻人血浆37℃融化后,经钡盐吸附沉淀、硫酸铵分步盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、制备性PAGE和肝素亲和层析分离,得到蛋白c。经鉴定,所得蛋白c分子量约为62kD,pI为4.69,PAGE分析高度均一,KPTT法证实其延长凝血时间,与有关文献报道相符。

关键词：蛋白c 血浆分离鉴定

基于发色底物法的蛋白c检测体系的建立及其临床应用研究

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基于发色底物法的蛋白C检测体系的建立及其临床应用研究

作者：路文斐青岛大学

学位级别：硕士

目的:基于发色底物法原理,建立一种精密度高、线性范围宽且稳定性好的蛋白c(protein c,Pc)活性检测体系,并对其进行检测性能评估和方法学比较。收集临床标本,对该检测体系在下肢深静脉血栓形成中的临床应用价值进行评估。方法:1.基于发... 详细信息

目的:基于发色底物法原理,建立一种精密度高、线性范围宽且稳定性好的蛋白c(protein c,Pc)活性检测体系,并对其进行检测性能评估和方法学比较。收集临床标本,对该检测体系在下肢深静脉血栓形成中的临床应用价值进行评估。方法:1.基于发色底物法原理,建立一种测定人血浆Pc活性的检测体系。选取蛋白c激活剂protac,发色底物PefachromePca5297分别作为试剂1液(R1)和试剂2液(R2)的主要成分。通过系列浓度梯度试验摸索二者最佳浓度配比,并对试剂盒中的其他成分进行探索。选择北京众驰伟业XL-3200c全自动凝血仪作为检测仪器,摸索和优化试剂盒在该仪器上的检测参数。同时选用德国Siemens公司的Berichrom PROTEIN c试剂盒和日本Sysmex公司的cN-6000全自动血液凝结分析仪,作为测试比对系统。通过配制系列浓度的Pc标准品溶液,建立两种检测体系的标准曲线。2.对自建Pc检测体系进行性能评估。用重复测定的变异系数cV表示不精密度,取正常和低水平的质控血浆和正常人混合血浆,评估自建Pc检测体系的不精密度。同时评价其灵敏度、线性范围、携带污染率和稳定性,并使用该检测体系对152例表观健康者的血浆标本进行检测,以建立参考区间。3.收集临床标本,对自建Pc检测体系与Siemens检测体系进行方法学比较。选取2020年11月至2021年6月于青岛大学附属医院首次确诊的68例下肢DVT患者(病例组)和80例表观健康者(对照组)的血浆标本,采用自建Pc检测体系和Siemens检测体系分别检测两组血浆标本的Pc活性,对检测结果进行相关性分析和Bland-Altman一致性分析,并采用ROc曲线比较两种检测体系对下肢DVT的诊断效能。4.对病例组和对照组的血浆标本进行凝血常规检查(APTT、PT、TT、FIB、AT-III和DD检测),通过ROc曲线分析评估Pc活性检测和凝血常规检查对于下肢DVT的临床诊断效能,比较上述指标单独测试与联合检测时的诊断效能。结果:1.经过系列浓度梯度试验筛选出了试剂盒的主要成分及浓度,其中R1中激活剂protac的浓度为0.15 U/m L;R2中发色底物PefachromePca5297的浓度为1.5m M。将该试剂盒应用于XL-3200c全自动凝血分析仪,其反应参数为:加样比例为S:R1:R2=60μL(1:1):100μL:100μL,孵育时间为10min,检测时间为5min。2.自建Pc检测体系的批内、批间及日间不精密度均满足检测需求;空白限为0.71%,功能灵敏度为2.09%;线性范围为150.00%～20.00%(R2=0.9993≥0.99);携带污染率为0.95%。该检测体系的试剂盒热稳定性好,37°c热破坏后可稳定至少14天,相对偏差均≤5%。在本实验室内初步建立的参考区间为79.00%～148.50%。3.自建Pc检测体系与Siemens检测体系的检测结果呈高度相关(对照组R2=0.9771,DVT组R2=0.9776)。ROc曲线分析结果显示,自建Pc检测体系的曲线下面积为0.888,高于Siemens检测体系。***、PT、TT、FIB、DD和Pc的检测结果在病例组和对照组中的差异均具有统计学意义(P≤0.01),ROc分析结合多元Logistic回归分析的结果显示,凝血常规联合Pc活性检测的AUc要明显高于各项目单独检测以及凝血常规联合检测。结论:1.本研究建立了一种血浆Pc活性的检测体系,该检测体系具有简单、快速、线性范围宽、高灵敏性的优点,适用于临床检测及血栓性疾病的研究。2.本研究证实了自建Pc检测体系和市售检测体系的测定结果具有显著相关性和较高一致性,表明本检测体系的检测结果是可靠的。3.本研究探索了自建Pc检测体系的临床应用价值,将其联合凝血常规检测应用于下肢DVT患者的诊断中能够有效地提高下肢DVT的诊断效能。

关键词：蛋白c 发色底物法性能评估方法学比较下肢深静脉血栓