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皮肤鳞状细胞癌puma基因外显子序列分析、mRNA水平和蛋白表达检测

皮肤鳞状细胞癌puma基因外显子序列分析、mRNA水平和蛋白表达检测

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作者：王明立昆明医科大学

学位级别：硕士

目的探讨皮肤鳞状细胞癌是否存在puma基因DNA序列、mRNA水平、蛋白质表达改变。方法优化并最终确立了puma基因3个高GC含量外显子的扩增条件;采用实时荧光定量PCR的方法检测puma mRNA水平;进行western blot险测PUMA蛋白的表达。 1.通过... 详细信息

目的探讨皮肤鳞状细胞癌是否存在puma基因DNA序列、mRNA水平、蛋白质表达改变。方法优化并最终确立了puma基因3个高GC含量外显子的扩增条件;采用实时荧光定量PCR的方法检测puma mRNA水平;进行western blot险测PUMA蛋白的表达。 1.通过对实验条件的摸索,确立了puma基因3个外显子最终的扩增条件,分别如下： (1)Exon2的反应体系为2×Mastermix30μl上下游引物(10μmol/L)各1.5μl,模板DNA3.0μl,ddH2O24μl,总体积60μl;反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、68℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 (2) Exon3的反应体系各组分和Exon2相同;反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、63℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 (3) Exon4的反应体系各组分和Exon2相同;反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、55℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 2.通过对实验条件的摸索,建立实时荧光定量PCR检测puma mRNA的方法。实时荧光定量法检测puma mRNA的反应体系：2×SYBR premix10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX0.4μl,cDNA1.0gl,灭菌水7.8μl,总体系20μl。扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,5个循环(不测荧光),95℃变性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,89℃延伸27s,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5min。内参GAPDH扩增体系同上,扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,5个循环(不测荧光),95℃变性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,78℃3s,72℃延伸30s,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5min。(注：应用于绘制标准曲线的质粒为本课题前期试验细菌保种的TA克隆方法构建的pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重组质粒) 3.用western blot的方法检测PUMA蛋白的表达,采用B-actin作为内参基因。结果 1.应用优化的扩增体系和条件对32例皮肤鳞状细胞癌组织的puma基因Exon2^3、4进行了PCR扩增,扩增产物测序后经Blast2序列比对分析,未发现任何突变。 2.采用实时荧光定量方法检测puma mRNA水平,puma mRNA在鳞癌组织和正常对照组中均有表达,但puma mRNA水平在皮肤鳞癌组织和正常皮肤对照组织的差异没有统计学意义(P>0.05)。 3.用western blot的方法检测PUMA蛋白的表达,采用?-actin作为内参基因,32例皮肤鳞癌组织和2例正常皮肤对照的内参基因均表达,但只有8例皮肤鳞癌组织和1例正常对照表达PUMA,且表达量都相对较低。结论 1. puma基因Exon2、3、4的编码序列保守且稳定。 2. puma mRNA的相对水平在皮肤磷癌组织和正常组织中的差异没有统计学意义。 3. PUMA蛋白在皮肤组织的表达相对较低。

关键词： puma 凋亡皮肤鳞癌突变 RT-PCR mRNA 蛋白western blot

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