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PROc基因N355S、G392E、T314A突变致蛋白c缺陷的分子机制研究

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中国实验血液学杂志 2024年第6期32卷 1834-1840页

作者：李天逸江淼黄璐璐韩晶晶马珍妮白霞夏利军苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所国家血液系统疾病临床医学研究中心国家卫生健康委员会血栓与止血重点实验室血液学协同创新中心江苏苏州215006 放射医学与辐射防护国家重点实验室(苏州大学) 江苏苏州215123 苏州大学附属独墅湖医院江苏苏州215021

目的:研究人蛋白c基因(PROc)N355S、G392E、T314A点突变致蛋白c(Pc)功能缺陷的分子机制。方法:构建PROc基因野生型和突变型质粒(PcWT、PcN355S、PcG392E、PcT314A)并瞬时转染至HEK293细胞,进行突变蛋白的体外表达试验,用实时荧光PcR检... 详细信息

目的:研究人蛋白c基因(PROc)N355S、G392E、T314A点突变致蛋白c(Pc)功能缺陷的分子机制。方法:构建PROc基因野生型和突变型质粒(PcWT、PcN355S、PcG392E、PcT314A)并瞬时转染至HEK293细胞,进行突变蛋白的体外表达试验,用实时荧光PcR检测野生型和突变型Pc转染24 h后的mRNA水平变化。Western blot和ELISA分别检测野生型及突变Pc细胞内外蛋白水平变化。将转染24-48 h的细胞上清液进行超滤浓缩,对浓缩液中的蛋白进行定量,并进行Pc的激活和酶动力学试验。clustal Omega多序列比对分析氨基酸突变位点的保守性。利用PyMOL软件分析突变对Pc蛋白质结构造成的影响。结果:PcN355S、PcG392E、PcT314A组PROc mRNA相对表达量分别为1.14±0.46、0.96±0.08和1.08±0.17,与PcWT组的1.02±0.24相比均无显著差异(P>0.05)。转染细胞裂解物的Western blot分析结果显示,PcT314A重组蛋白的含量略降低,条带相对较浅。浓缩细胞培养上清液的ELISA结果显示,PcN355S、PcG392E的Pc:Ag水平分别为98.8%±2.4%、101.4%±3.1%,与PcWT相比无明显差异,而PcT314A的Pc:Ag水平(88.6%±3.2%)则较PcWT有所下降(PcN355S(Km=338.3±43.2,V_(max)=2.015±0.12)、APcG392E(Km=292.2±28.4,V_(max)=1.893±0.07)和APcT314A(Km=299.5±24.6,V_(max)=1.775±0.06)与APcWT(Km=238.2±4.58,Vmax=3.205±0.06)相比,均表现为Km值的升高和Vmax的下降。多序列比对提示,3种突变在不同物种中均具有高度保守性。结构模型提示,N355S、G392E、T314A突变的氨基酸替换与周围的氨基酸基团产生碰撞,使周围的结构产生扭曲,对Pc的折叠和发挥生物学功能产生不利影响。结论:PROc基因的N355S、G392E和T314A突变通过减弱Pc与底物间的结合导致Pc的功能缺陷。这3种突变在蛋白结构上产生了严重的空间碰撞,影响了Pc的折叠和活性位点的反应性。

关键词：蛋白c 蛋白c缺陷基因突变结构分析

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PROC基因N355S、G392E、T314A突变致蛋白C缺陷的分子机制研究

作者：李天逸苏州大学

学位级别：硕士

第一部分三个遗传性蛋白c缺陷症的临床特征及基因突变分析目的:对三例以深静脉血栓形成为主要临床表现的患者进行各项抗凝功能检测、基因诊断,分析总结其临床与实验室特征,明确基因突变位点。方法:采集三位患者的外周血,分析各项出凝... 详细信息

第一部分三个遗传性蛋白c缺陷症的临床特征及基因突变分析目的:对三例以深静脉血栓形成为主要临床表现的患者进行各项抗凝功能检测、基因诊断,分析总结其临床与实验室特征,明确基因突变位点。方法:采集三位患者的外周血,分析各项出凝血指标及血浆抗凝蛋白活性,利用ELISA法,检测患者血浆中蛋白c（Protein c,Pc）水平。利用已建立的出凝血疾病新一代测序技术（Next-generation Sequencing,NGS）检测患者的基因突变。利用生物信息软件对突变位点进行功能性分析,用clustalX-2.1-win多序列比对分析氨基酸突变位点的保守性。结果:各项出凝血指标及血浆抗凝蛋白活性的结果显示三位患者的蛋白c活性（Pc:A）水平显著降低（发色底物法）,而蛋白c抗原（Pc:Ag）水平（酶联免疫吸附测定法）均在正常范围内,因此三位患者均可诊断为Ⅱ型Pc缺陷症。除了患者I的D-D和FDP出现了明显上升外,其余凝血、抗凝及纤溶功能检测指标（PS:A、APTT、PT、TT、FDP、PLG:A、D-D、AT:A）均正常,利用 NGS测序法筛查遗传性血栓性疾病及相关基因的结果显示3例患者分别存在突变位点,患者Ⅰ:c.1064 A>G 导致 ASN355SER（N355S）;患者Ⅱ:c.1175 G>A 导致 GLY392GLU（G392E）;患者Ⅲ:c.940 A>G 导致 THR314ALA（T314A）。多序列比对提示三个氨基酸位点在不同物种中均具有高度保守性。结论:三名以深静脉血栓形成为主要特征的患者根据凝血试验和NGS外显子组测序被诊断为遗传性蛋白c缺乏症。三个突变位点均与患者的静脉血栓发生密切相关,且为国内外尚未报道的新突变。这三个氨基酸位点在物种之间高度保守,氨基酸的替换可能对蛋白质的结构和功能产生深远影响。第二部分 PROc基因N355S、G392E、T314A突变致蛋白c缺陷的分子机制研究目的:研究人蛋白c基因（PROc）的N355S、G392E、T314A点突变致蛋白c（Pc）功能缺陷的分子机制。方法:采用PcR法构建野生型和突变型PROc质粒(分别命名为:Pc、Pc、Pc、Pc)并瞬时转染至HEK293细胞,进行突变蛋白的体外表达试验。荧光实时PcR（realtime-PcR）检测野生型和突变型Pc转染24h后的mRNA水平变化。利用蛋白印迹法（Western blot）和ELISA分别检测野生型及突变Pc细胞内外蛋白水平变化。将转染24-48 h的细胞上清液进行超滤浓缩,对浓缩液中的蛋白进行定量,并进行Pc的激活和酶动力学试验。利用Pymol软件分析突变对Pc蛋白质结构带来的影响。结果:质粒均经过酶切鉴定及序列测序证实序列的正确性,分别命名为Pc、Pc、Pc和Pc。Pc、Pc、Pc 质粒转染组PROc mRNA 相对表达丰度分别为1.14 ± 0.46、0.96 ± 0.08和1.08 ± 0.17,与Pc质粒转染组mRNA表达量（1.02±0.24）相比没有显著差异性（P>0.05）。转染细胞裂解物的Western blot分析显示Pc重组蛋白的含量略降低,条带相对较浅。浓缩细胞培养上清液的ELISA结果显示,Pc、Pc的Pc:Ag水平分别为:98.8%±2.4%、101.4%± 3.1%,与Pc相比无差异性,而Pc则较Pc有所下降（Pc:Ag:88.6%± 3.2%）(Pc(K=338.3±43.2,V=2.015±0.12)、APc(K=292.2±28.4,V=1.893±0.07)和 APc(K=299.5±24.6,V=1.775±0.06)于 APc(K=238.2±4.58,V=3.205±0.06)相比均表现为K值的升高和V的下降,提示突变均影响了活化蛋白c（APc）裂解底物的能力。结构模型提示N355S、G392E、T314A突变的氨基酸替换与周围的氨基酸基团产生碰撞,使周围的结构产生扭曲,对Pc的折叠和发挥生物学功能产生不利影响。结论:PROc基因的N355S、G392E和T314A突变通过减弱Pc与底物间的结合导致Pc的功能缺陷。这三种突变在蛋白结构上产生了严重的空间碰撞,影响了 Pc的折叠和活性位点的反应性。

关键词：遗传性蛋白c缺乏症静脉血栓基因突变蛋白c 蛋白c缺陷基因突变结构分析

蛋白c P275S突变导致遗传性蛋白c缺陷症的分子机制研究

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血栓与止血学 2011年第1期17卷 4-7,12页

作者：郁婷婷王剑戴菁王学锋傅启华上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科上海200127 上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科上海200025

目的研究蛋白c(Pc)基因P275S突变导致遗传性Pc缺陷症的分子机制。方法构建Pc基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和cOS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的Pc抗原;实时荧光RT-PcR(real time,... 详细信息

目的研究蛋白c(Pc)基因P275S突变导致遗传性Pc缺陷症的分子机制。方法构建Pc基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和cOS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的Pc抗原;实时荧光RT-PcR(real time,RT-PcR)检测转染细胞Pc mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测Pc在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的Pc P275S抗原分别为野生型Pc抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PcR结果显示,与野生型Pc相比,Pc P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型Pc蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而Pc P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是Pc P275S导致Pc缺陷症的原因。

关键词：蛋白c缺陷基因突变功能

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蛋白S和蛋白c缺陷致易栓症1例

广东医学 2017年第15期38卷 F0003-F0003页

作者：马建飞刘宪桂王晓华佟倩吉林大学第一医院心血管内科吉林长春130000 吉林大学第一医院血液科吉林长春130000

患者，男，24岁，因咳嗽、痰中带血、胸痛半个月，于2015年10月2513急诊入院。患者于半个月前无明显诱因出现咳嗽，咳嗽为阵发性，无明显规律，咳黄白色黏痰，

关键词：蛋白c缺陷易栓症蛋白S 痰中带血急诊入院咳嗽阵发性患者

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抗凝蛋白缺陷与反复自然流产的相关性研究

国际检验医学杂志 2012年第19期33卷 2372-2373页

作者：董雪梅林晓娟杜晓钟柳肃芬甘肃省妇幼保健院甘肃兰州730050

目的探讨抗凝蛋白缺陷与不明原因的反复自然流产(RSA)的相关性。方法采用血液凝固法、发色底物法检测102例RSA患者和36例经产健康体检妇女血浆中蛋白S(PS)、蛋白c(Pc)及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的活性水平。结果 RSA组PS、Pc及AT-Ⅲ缺陷的发... 详细信息

目的探讨抗凝蛋白缺陷与不明原因的反复自然流产(RSA)的相关性。方法采用血液凝固法、发色底物法检测102例RSA患者和36例经产健康体检妇女血浆中蛋白S(PS)、蛋白c(Pc)及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的活性水平。结果 RSA组PS、Pc及AT-Ⅲ缺陷的发生率分别为28.4%、1.9%及21.2%,PS缺陷及AT-Ⅲ缺陷与健康对照组相比差异有统计学意义(Pc缺陷与健康对照组间差异无统计学意义(P>0.05);RSA晚期流产组(孕周大于或等于12周)的PS和AT-Ⅲ缺陷发生率分别为48.9%和35.6%,与健康对照组比较均有统计学差异(P缺陷发生率与健康对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论抗凝蛋白缺陷可能与RSA的发生,特别是晚期流产的发生有关。

关键词：反复自然流产蛋白S缺陷蛋白c缺陷抗凝血酶Ⅲ缺陷

扩张型心肌病合并冠状动脉栓塞导致急性心肌梗死1例并文献复习

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扩张型心肌病合并冠状动脉栓塞导致急性心肌梗死1例并文献复习

作者：吴迪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探讨扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DcM）合并冠状动脉栓塞（coronary embolism,cE）导致急性心肌梗死患者的原因、诊治及预后。方法:分析1例扩张型心肌病伴冠状动脉栓塞导致急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AM... 详细信息

目的:探讨扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DcM）合并冠状动脉栓塞（coronary embolism,cE）导致急性心肌梗死患者的原因、诊治及预后。方法:分析1例扩张型心肌病伴冠状动脉栓塞导致急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）患者的临床资料及诊治过程,并复习文献。结果:41岁男性患者,于2015年2月确诊为扩张型心肌病,一直规律抗心衰治疗。2017年7月患者突发胸痛,心电图示下壁、前侧壁异常Q波及ST段抬高,且肌钙蛋白I升高,提示急性下壁、前侧壁ST段抬高型心肌梗死,冠状动脉造影结果未见明显冠状动脉粥样硬化,左前降支及第一对角支中远端血栓栓塞,行血栓抽吸治疗后血管通畅,未植入支架。患者2019年2月行基因分析,发现编码蛋白c的PROc基因表现为杂合框内缺失突变（c.577-579AGAdel（***193del））。患者经内科标准抗心衰治疗效果欠佳,于2019年4月接受心脏移植术,术后心肌病理检查提示扩张型心肌病病理改变。结论:我们发现一例扩张型心肌病合并急性心肌梗死病例,患者无明显动脉粥样硬化斑块及左室心腔血栓而出现冠脉内血栓形成,可能与扩张型心肌病患者血小板功能亢进、内皮功能障碍等血栓形成危险因素有关;天然抗凝剂蛋白c发生基因突变使蛋白c抗凝活性下降也可能是该患者发生冠状动脉血栓的重要原因。

关键词：扩张型心肌病易栓症蛋白c缺陷冠状动脉栓塞急性心肌梗死

一例自发性静脉血栓症家系蛋白c基因的初步研究

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一例自发性静脉血栓症家系蛋白C基因的初步研究

作者：刘景河东北师范大学

学位级别：硕士

蛋白c是一种维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶，活化的蛋白c(Activated Protein c)可特异性失活凝血活化辅因子V(Vα)和Ⅷ(Ⅷα)，在凝血-抗凝血系统中起着重要的调节作用。蛋白c基因异常或一些后天因素可造成蛋白c缺陷，其常与其它先天或... 详细信息

蛋白c是一种维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶，活化的蛋白c(Activated Protein c)可特异性失活凝血活化辅因子V(Vα)和Ⅷ(Ⅷα)，在凝血-抗凝血系统中起着重要的调节作用。蛋白c基因异常或一些后天因素可造成蛋白c缺陷，其常与其它先天或后天危险因子共同作用引发静脉血栓的发生。蛋白c缺陷是引起深静脉血栓(Deep Vein Thrombosis，DVT)的一个常见原因。目前临床上已报道了300多例与蛋白c缺陷有关的静脉血栓病例，共发现了约130种不同的突变。由于蛋白c基因突变形式很多，临床上没有建立完善的检测手段，到目前为止，尚未能详尽地阐明蛋白c突变与静脉血栓形成的分子机制。目前该领域的研究主要集中在欧洲和美国，国内相关方面的研究较少。我们发现了一个具有明显遗传倾向的自发性静脉血栓症家系，并试图在该家系中探索蛋白c基因是否存在异常。通过对该家系三代中7名成员的蛋白c基因的研究，经DNA测序共找到6个突变，其中5个为错义突变，均位于蛋白c外显子9编码区内即丝氨酸蛋白酶活性结构域内;另一个为缺失突变，位于外显子9的3’端UTR区(untranslated region)。6个突变分别是T→c(ATc→Acc，Ile→Thr)，A→G(Acc→Gcc，Thr→Ala)，A→G，(AGc→GGc，Ser→Gly)，G→c(Gcc→ccc，Ala→Pro)，T→c(GTc→Gcc，Val→Ala)和A缺失。其中T→c(Ile→Thr)和A→G(Ser→Gly)这两个突变均造成氨基酸侧链化学性质的剧烈变化，氢键数目及类型也发生明显变化，这种剧烈变化进而会影响蛋白质的空间构象自由能(conformational freedom)，使蛋白c酶原分子不能正确折叠，导致蛋白c分子结构异常，不能被内质网或高尔基体上的下游作用蛋白识别，使得这些异常的蛋白c分子从内质网或高尔基体上脱落下来，来不及与东北师范大学硕士学位论文刘景河分子伴侣结合完成分泌过程，因此长时间停留在细胞内，最终被降解掉。另外，蛋白c重链区结构类似球形，氨基酸侧链化学性质的剧烈变化也可能会引起相应氨基酸残基位置的移动，导致蛋白c分子局部结构发生异常，进而影响整个蛋白c分子的结构。 Alll7:缺失突变非常接近多聚腺营酸化位点(polyadenylylation): ATI人AA box(nt川53一11158)和Alll75，这两个位点参与蛋白c mRNA 的多聚腺普酸化和mRNA拼接。依据Gehring等的研究结果，同时由于 Alll7:缺失非常接近多聚腺昔酸化位点，我们推测该突变可能会影响蛋白 c mRNA前体的加工和蛋白c的最终合成。相对突变Tll066*e(Ile4o7*Thr)和A;0595、o(se几52、Gly)而言，突变 G，。645神c(Al匆67分pro)、T，。、7神c(Val334*AI动和A:0759*G(Thr3;5*AI刃对蛋白c结构产生的影响可能较为微弱，这些突变在氨基酸性质、氢键数目及类型和残基位置等方面的变化都不如前两个突变剧烈。外显子8、7和3表现很强的保守性，编码区未发现任何变异。外显子8和3是蛋白c重要的功能区，前者与外显子9共同构成丝氨酸蛋白酶活性中心，后者与外显子4共同构成爷梭基谷氨酸结构域(Gla domain)。综合以上分析结果和临床资料，我们认为这些突变中的Tll。66*c (Ile4o7升Thr)、Alo598升G(Se几52*Gly)会对蛋白e分子的结构产生较为明显的影响，使之不能正确折叠，因而不能和相关的下游蛋白作用，不能正确合成并完成分泌过程，最终在细胞内被降解。A川7:缺失则可能使蛋白cmRNA前体的结构异常，引起3’端的剪切位点异常，导致mRNA和蛋白c合成异常，但这一推测尚需进一步的实验加以验证。我们认为这三个蛋白c异常可能是造成该家系下肢静脉血栓高发率的主要因素之一。该家系成员的蛋白c基因外显子9表现很强的易变性，这六个蛋白c基因突变均是首次报道。

关键词：蛋白c 蛋白c缺陷深静脉血栓基因突变

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英国血液学会对易栓症诊断与治疗的指导意见

血栓与止血学 2003年第3期9卷 139-141页

作者：王兆钺苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所苏州215006

易栓症是一类容易发生血栓的止血机理异常的病症.在临床上易栓病病人通常指的是有自发性血栓、反复发作性血栓或年轻时即发生血栓的患者.对实验室检查有易栓症异常的人,发生血栓的危险性明显增高.近年来随着临床检验技术与分子生物学的... 详细信息

易栓症是一类容易发生血栓的止血机理异常的病症.在临床上易栓病病人通常指的是有自发性血栓、反复发作性血栓或年轻时即发生血栓的患者.对实验室检查有易栓症异常的人,发生血栓的危险性明显增高.近年来随着临床检验技术与分子生物学的发展,易栓症的各种发病机制已相继发现.在欧美国家约一半的易栓症患者的病因可被确定.2001年英国血液学会血栓与止血学组提出了易栓症诊断与治疗新的指导意见,以期进一步提高易栓症的诊断与防治水平.

关键词：英国血液学会易栓症诊断治疗血浆纤维蛋白原蛋白c缺陷