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Muc3羧基端SEA组件完整性与蛋白酶切的关系

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解放军医学杂志 2007年第7期32卷 726-728页

作者：汪荣泉房殿春第三军医大学西南医院全军消化疾病专科中心重庆400038

目的探讨大鼠黏蛋白3(Muc3)羧基端SEA组件的完整性与蛋白酶切的关系。方法对截断了的大鼠Muc3的羧基端(p20t和p20SEA)采用定点突变的方法在所要求的位点插入终止密码子,采用SDS/PAGE和Western blot方法检测蛋白表达,N-glycosidase F消... 详细信息

目的探讨大鼠黏蛋白3(Muc3)羧基端SEA组件的完整性与蛋白酶切的关系。方法对截断了的大鼠Muc3的羧基端(p20t和p20SEA)采用定点突变的方法在所要求的位点插入终止密码子,采用SDS/PAGE和Western blot方法检测蛋白表达,N-glycosidase F消化法对表达蛋白质行脱N型糖链。结果Muc3完整的羧基端产物翻译后经蛋白酶切产生30kD的氨基端酶切片段和49kD的羧基端酶切片段,30kD的氨基端酶切片段经脱N型糖链后分子量变为22kD;含完整SEA组件但不含SEA组件后续氨基酸的截断大鼠Muc3羧基端用V5抗体可以检测到30kD的表达产物,脱N型糖链后分子量变为22kD;含不完整SEA组件的截断的大鼠Muc3羧基端用V5抗体可以检测到26～30kD的表达产物,脱N型糖链后分子量变为26kD。结论Muc3完整的羧基端产物和SEA组件完整但不含SEA组件后续氨基酸的大鼠Muc3羧基端均在翻译后经历了蛋白酶切,但是SEA组件不完整的大鼠Muc3羧基端在翻译后未能出现蛋白酶切,提示SEA组件完整性是Muc3羧基端蛋白酶切反应发生的一个重要条件。

关键词：黏蛋白类蛋白酶切 SEA组件脱糖基化

肠粘蛋白MUC3羧基末段翻译后蛋白酶切片段间的相互连接

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第三军医大学学报 2006年第4期28卷 287-290页

作者：汪荣泉房殿春第三军医大学西南医院全军消化内科中心重庆400038

目的探讨大鼠MUC3羧基端在翻译后经历蛋白酶切所产生的两个酶切片段的存在方式。方法肠粘蛋白MUC3羧基末端的表达采用体外的瞬时表达系统,表达的蛋白质采用WESTERN BLOTTING检测,两个酶切片段的连接鉴定采用示踪/追踪(PULSE/CHASE)及其... 详细信息

目的探讨大鼠MUC3羧基端在翻译后经历蛋白酶切所产生的两个酶切片段的存在方式。方法肠粘蛋白MUC3羧基末端的表达采用体外的瞬时表达系统,表达的蛋白质采用WESTERN BLOTTING检测,两个酶切片段的连接鉴定采用示踪/追踪(PULSE/CHASE)及其免疫沉淀实验和HIS.BIND镍树脂亲和纯化方法。结果MUC3羧基末端在翻译后经蛋白酶切产生分子质量为49000和分子质量为30000的两个片断,尚有少量分子质量为55000的未被酶切的全长产物。酶切发生在该蛋白生物合成的内质网阶段,两个酶切片段通过非共价键及SDS敏感的相互作用连接在一起。结论这种早期的蛋白酶切反应可能是其细胞表面的很大的细胞外成分最终脱离的前奏,但是两个酶切片段锚定在细胞膜上的相互作用是影响细胞外成分最终脱离的重要因素。

关键词：蛋白酶切翻译后修饰连接转染代谢标记

黏蛋白3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制对其细胞膜定位的影响

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解放军医学杂志 2008年第7期33卷 823-825页

作者：何勇虹李宜成彭志红汪荣泉第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆400038

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1... 详细信息

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1细胞,抑制其表达蛋白质的N型糖链合成。采用免疫荧光定位法,用抗V5抗体和抗Myc抗体检测Muc3蛋白的表达。结果在甲醇固定的COS-1细胞,细胞核周和细胞表面均能检测到完整的Muc3羧基端p20表达产物;在未经甲醇固定的COS-1细胞,免疫荧光仅限于细胞表面。缺失的rMuc3羧基端的p20t表达产物仅能在细胞核周检测到。Muc3羧基端建立的蛋白酶切阴性突变体p20s/a与p20转染细胞的荧光分布相近。衣霉素抑制糖链合成后不影响膜定位。结论Muc3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制不能影响Muc3的细胞膜定位,影响其定位的因素主要是SEA组件靠近羧基端的区域,包括该分子的跨膜区和胞质内区域。

关键词：黏蛋白类蛋白酶切糖基化

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作物叶片蛋白质组提取与酶切方法比较研究

作物杂志 2016年第2期 50-56页

作者：苏小琴魏红茹段双梅赵明潘映红云南农业大学龙润普洱茶学院云南昆明650201 中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程北京100081 河北农业大学农学院河北保定071000

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液(pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、... 详细信息

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液(pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐)和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。

关键词：蛋白质组样品制备蛋白酶切作物叶片

重组蛋白药物游离巯基荧光法检测方法探索、优化及验证

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药物分析杂志 2023年第9期43卷 1533-1542页

作者：刘振东高晗江楠杨勇王庆民安振明齐鲁制药有限公司生物技术开发研究院济南250100

目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测,首先对蛋白变性条件进行摸索优化,确定了变性剂种类及变性条件,并采用重组蛋白药物进行了方法验证,结果均符合... 详细信息

目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测,首先对蛋白变性条件进行摸索优化,确定了变性剂种类及变性条件,并采用重组蛋白药物进行了方法验证,结果均符合验证标准。但在采用该方法对我公司PEG-GCSF和KGF产品(分子序列中理论均含有1 mol巯基/mol蛋白)进行检测时,发现游离巯基检测值均显著低于理论值,检测值最高仅为理论值的29%,可能与蛋白分子内部包埋的游离巯基未充分暴露有关。因此,本研究在已有分析方法的基础上采用蛋白酶酶解的方式,充分暴露蛋白分子中的游离巯基,并对样品的酶切条件及其他关键参数进行了优化,对优化后的分析方法进行了方法学验证。结果:通过筛选,确定了最佳变性条件:终浓度为8 mol·L^(-1)尿素37℃孵育30 min。针对已知理论游离巯基含量的重组蛋白1(PEG-GCSF)和重组蛋白2(KGF)产品游离巯基检测值明显低于理论值的问题,采用蛋白酶切方式,酶切条件为蛋白酶K酶切(目的蛋白):蛋白酶K(20∶1,w:w),37℃孵育1 hr,酶解后检测巯基实测值与理论值一致。经验证该方法实测结果RSD均蛋白酶酶切的方式进行样品前处理,充分暴露重组蛋白药物分子内包埋的游离巯基,解决了复杂重组蛋白药物产品中游离巯基无法准确定量的难题,为该类蛋白分子中微量游离巯基的定量测定和表征研究提供了方法和参考。

关键词：重组蛋白药物游离巯基荧光法蛋白酶切已知巯基含量重组蛋白方法优化方法验证

Furin在神经精神疾病中作用机制的研究进展

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生命科学 2020年第5期32卷 439-445页

作者：汪洋吕宸束会娟黄青芸刘媛媛谭国鹤广西医科大学广西生物医药协同创新中心广西再生医学重点实验室南宁530021 广西医科大学基础医学院南宁530021 长寿与老年相关疾病教育部重点实验室南宁530021 广西特色新型智库——中国-东盟脑科学创新发展研究中心南宁530021

弗林蛋白酶(Furin)作为细胞内具有剪切活性的蛋白酶,在众多蛋白质的生产和分泌过程中通过剪切不具备生物学活性前体蛋白的特定位点,使其活化获得相应生物学功能。作为一种重要的前体蛋白转化酶,Furin在神经系统中的作用底物主要包括一... 详细信息

弗林蛋白酶(Furin)作为细胞内具有剪切活性的蛋白酶,在众多蛋白质的生产和分泌过程中通过剪切不具备生物学活性前体蛋白的特定位点,使其活化获得相应生物学功能。作为一种重要的前体蛋白转化酶,Furin在神经系统中的作用底物主要包括一些生长因子、基质金属蛋白酶、肽类激素及其前体等,这些底物对癫痫、阿尔茨海默病、缺血性脑卒中和精神分裂症等重大神经精神疾病的发生发展具有重要的调控作用。该文概述了Furin的基本结构与生物学功能,Furin在一些重要神经精神疾病中的具体作用、相应机制,以及Furin活性调节剂等方面的最近研究进展。

关键词：前体蛋白转化酶弗林蛋白酶蛋白酶切活性调节神经疾病

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大豆种子蛋白质组样品制备与数据分析方法

生物技术通报 2020年第12期36卷 247-255页

作者：牟永莹王道平陈明邱丽娟潘映红中国农业科学院作物科学研究所北京100081

构建一种适用于大豆种子蛋白质组样品制备与液相质谱分析的技术体系,为深入研究大豆蛋白组学创造条件。以大豆品种中黄35成熟期种子为材料,分别对常用的蛋白质提取、酶切、液相分离梯度和数据库进行比较分析。结果表明,使用改进的尿素... 详细信息

构建一种适用于大豆种子蛋白质组样品制备与液相质谱分析的技术体系,为深入研究大豆蛋白组学创造条件。以大豆品种中黄35成熟期种子为材料,分别对常用的蛋白质提取、酶切、液相分离梯度和数据库进行比较分析。结果表明,使用改进的尿素硫脲蛋白提取法配合赖氨酸C端内切酶/胰蛋白酶顺序酶切法制备的质谱分析样品,经90 min纳升级液相梯度分离和质谱分析,最后采用UniProt数据库解谱时,大豆种子蛋白鉴定数目最多。将此方法应用于大豆品种十胜长叶成熟种子样品制备和分析,3次样品制备重复试验共鉴定非冗余蛋白2244组,其中61%蛋白质可被重复鉴定。该方法具有一定的可靠性和稳定性,适用于大豆种子蛋白质组样品制备和数据分析。

关键词：蛋白质组样品制备蛋白酶切大豆种子

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水稻白叶枯病无毒因子Ax21成熟机理初探

水稻白叶枯病无毒因子Ax21成熟机理初探

作者：郑勇浙江师范大学

学位级别：硕士

白叶枯病是仅次于稻瘟病的水稻第二大病害,Xa21是最早发现的白叶枯病抗性基因,具广谱抗性,其无毒基因ax21在2009年底被确定。ax21翻译产物Ax21（activator of XA21-mediated immunity）为194个氨基酸的蛋白质,包含外泌信号肽,硫酸化17肽... 详细信息

白叶枯病是仅次于稻瘟病的水稻第二大病害,Xa21是最早发现的白叶枯病抗性基因,具广谱抗性,其无毒基因ax21在2009年底被确定。ax21翻译产物Ax21（activator of XA21-mediated immunity）为194个氨基酸的蛋白质,包含外泌信号肽,硫酸化17肽axYs22,后续多肽链三个部分。Ax21是目前发现首个直接作用于宿主受体,引发抗性反应的群体感应因子,也是革兰氏阴性菌中首次发现的介导调控运动,生物膜形成,毒力相关基因表达的群体感应因子。目前,已相继发现raxST, RaxP, RaxH等十余个基因参与Ax21的翻译及活性调控。研究发现,Ax21硫酸化17肽是引起水稻抗性的活性物质,Ax21的成熟必须经N端第22位酪氨酸的硫酸化修饰,Ⅰ类分泌系统（type Ⅰ secretion system, TOSS）分泌出胞外,蛋白酶切去后续多肽链等过程。为探究Ax21成熟机理,我们主要进行了三部分的研究工作：Ax21硫酸化部位定位与酶切部位定位;RaxST与Ax21蛋白的表达纯化;农杆菌介导SAC基因转化水稻。研究表明RaxST利用PAPS作为硫酸根的供体催化Ax21的硫酸化。构建raxST C端具CFP的单交换载体pSKB4-raxST-CFP,电转化至感受态白叶枯病菌PXO99,经氨苄青霉素抗性筛选获得单交叉重组菌株。通过荧光显微镜观察,发现CFP荧光信号位于胞内,推测Ax21的硫酸化发生于白叶枯病菌细胞内。蛋白酶切去后续多肽是Ax21成熟的必须过程,构建了Ax21C端具GFP的单交换载体pSKB4-ax21-GFP,通过电转化至感受态白叶枯病菌PXO99,经氨苄青霉素抗性筛选获得单交叉重组菌株。通过荧光显微镜观察发现GFP荧光信号位于胞内,推测Ax21的蛋白酶切发生在胞内,或GFP的存在影响了Ax21的分泌。 Ax21硫酸化由RaxST催化完成,目前尚没有对RaxST的催化活性及反应具体条件进行分析。我们分别把Ax21与RaxST构建到原核表达载体pET30a与pSKB4高效表达Ax21与RaxST蛋白,电泳发现Ax21与RaxST均存在于包含体。通过尿素溶解,复性纯化,我们得到了较高纯度的Ax21与RaxST蛋白,为Ax21体外硫酸化活性分析奠定了基础。硫是生命活动必须的化学元素,研究表明许多含硫化合物参与了植物细胞的防卫反应,大田实验也表明硫可以诱导植物抗病性的产生。Ax21的成熟也必须经历硫酸化修饰,本实验室研究表明,施硫量的多少,影响水稻对白叶枯病的抗性。利用转基因技术,我们将高效同化硫的球形红细菌SAC基因转化入水稻,获得了32个转基因株系,为进一步分析硫代谢对水稻的抗病能力奠定了基础。

关键词：无毒因子硫酸化蛋白酶切荧光定位硫酸盐活化酶复合体

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基于超滤辅助样品制备方法的优化

生物技术通讯 2014年第1期25卷 82-86页

作者：马成张琪潘一廷覃培斌钱小红应万涛北京理工大学生命学院北京100081 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京102206 新加坡南洋理工大学生命学院新加坡637551

目的:基于超滤辅助样品制备(FASP)方法的出现使得使用去污剂(如SDS)的蛋白质提取方法与溶液内酶切方法得以兼容,因此提高了难溶性蛋白的鉴定数量。然而,超滤膜的非特异性吸附作用依然会造成蛋白的损失。我们拟针对该方法存在的问题对其... 详细信息

目的:基于超滤辅助样品制备(FASP)方法的出现使得使用去污剂(如SDS)的蛋白质提取方法与溶液内酶切方法得以兼容,因此提高了难溶性蛋白的鉴定数量。然而,超滤膜的非特异性吸附作用依然会造成蛋白的损失。我们拟针对该方法存在的问题对其进行改进。方法:对FASP方法进行了蛋白酶切条件、洗脱液选择、洗脱次数的改进;为测试优化方法的有效性和适用范围,选择标准蛋白BSA、鼠肝和鼠脑等3种样品进行考察。结果:相比报道的FASP方法,采用改进后的FASP方法使BSA的回收率提高了20%;经高精度质谱检测,对鼠肝、鼠脑的蛋白质鉴定结果分别比采用未优化的FASP多鉴定到2086和3592条特异肽段。结论:通过对FASP方法的优化,蛋白鉴定数量得到较大提高,该方法为蛋白质组深度覆盖研究提供了可靠的技术手段。

关键词：基于超滤辅助样品制备蛋白酶切超滤管深度覆盖