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蛋白酶体抑制通过GSK-3β抑制Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

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蛋白酶体抑制通过GSK-3β抑制Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

作者：吴建慧广州医学院

学位级别：硕士

背景泛素-蛋白酶体系统是真核细胞最主要的胞内蛋白降解途径。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)参与许多细胞进程,包括细胞周期、细胞增殖、氧化应激等。UPS主要通过三种蛋白水解作用(糜蛋白酶样作用、胰蛋白酶样... 详细信息

背景泛素-蛋白酶体系统是真核细胞最主要的胞内蛋白降解途径。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)参与许多细胞进程,包括细胞周期、细胞增殖、氧化应激等。UPS主要通过三种蛋白水解作用(糜蛋白酶样作用、胰蛋白酶样作用和半胱天冬酶样作用)来降解靶蛋白。肽醛(例如:MG132)和硼酸肽可以可逆地抑制蛋白降解作用,而β-内酯衍生物(例如:lactacystin)和环氧酮(例如:环氧酶素)可以不可逆地抑制蛋白降解。近年发现,UPS在各种心血管疾病的发生发展中也发挥重要作用。有研究证明,蛋白酶体抑制可以通过降低NF-κB的活性而减轻压力负荷导致的心肌重构,从一定程度上逆转心肌肥大。另外在原代新生大鼠心肌细胞也发现,部分抑制蛋白酶体活性可抑制心肌肥大。GSK-3作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶,参与调节许多细胞功能如代谢、转录、翻译、细胞生长和凋亡。以往研究证实,GSK-3β是一种内源性心肌肥大负调控因子。GSK-3β激活可磷酸化一些促心肌肥大因子如真核翻译起始因子(eIF) 2Bε,活性T细胞核因子(NFAT) , GATA4和myocardin而使它们失去活性,进而抑制心肌肥大。而本项目组曾在培养的人胚肾细胞(HEK293)发现,蛋白酶体抑制可以明显提高GSK-3β的活性。本文用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验,第一部分主要探讨蛋白酶体抑制对心肌肥大的作用以及对GSK-3β活性的影响;第二部分研究蛋白酶体抑制改善心肌肥大的机制,从而为心肌肥大的机制研究提供新的思路。第一部分蛋白酶体抑制对心肌细胞肥大的改善作用及对GSK-3活性的影响目的1.蛋白酶体抑制剂对心肌肥大的作用2.蛋白酶体抑制剂对心肌细胞GSK-3β活性的影响方法选用原代培养的新生SD大鼠心肌细胞进行实验。用AngⅡ(100nM)诱导心肌肥大模型,同时给予蛋白酶体抑制剂lactacystin(1μM)共同孵育细胞24小时。用荧光底物法检测蛋白酶体糜样蛋白酶活性。检测胚胎型基因ANF mRNA表达、蛋白合成速率和心肌表面积等心肌肥大指标。用Western-blot法检测各分组心肌细胞p-GSK-3β表达的变化。结果1.给予蛋白酶体抑制剂lactacystin(1μM)处理细胞24小时后,蛋白酶体糜样蛋白酶活性显著降低(P蛋白酶体抑制剂lactacystin (1μM)处理Ang-Ⅱ(100 nM)诱导的心肌细胞24小时后, lactacystin抑制AngⅡ诱导的心肌细胞胚胎型基因ANF mRNA表达增多,蛋白合成速率、心肌细胞表面积增加(P蛋白酶体抑制剂lactacystin (1μM)处理Ang-Ⅱ(100nM)诱导的心肌细胞24小时后,用Western blot法检测GSK-3β活性的改变情况。结果发现在24小时,与心肌肥大组相比,lactacystin明显降低Ang-Ⅱ诱导的p-GSK3β(ser9)表达,即GSK-3β活性升高,表明lactacystin可引起肥大心肌细胞的GSK-3β活性升高。小结蛋白酶体抑制剂可以改善Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,同时可以使肥大心肌细胞GSK-3β活性升高。第二部分蛋白酶体抑制通过GSK-3β改善心肌细胞肥大目的蛋白酶体抑制是否通过GSK-3β途径改善心肌肥大。方法在第一部分的研究基础上,给予GSK-3的抑制剂LiCl (10μM),Ang-Ⅱ(100nM), lactacystin (1μM)共孵育心肌细胞24小时,以下调GSK-3的活性。用荧光底物法检测蛋白酶体糜样蛋白酶活性。检测胚胎型基因ANF mRNA表达、蛋白合成速率和心肌表面积等心肌肥大指标。用Western-blot法检测各分组心肌细胞p-GSK3β(ser9)蛋白表达的变化。结果1.给予蛋白酶体抑制剂lactacystin处理细胞24小时后,蛋白酶体糜样蛋白酶活性显著降低(P蛋白酶体糜样蛋白酶活性也明显降低(P抑制剂LiCl后,lactacystin抑制的肥大心肌心肌细胞中胚胎型基因ANF mRNA表达增多,蛋白合成速率、心肌细胞表面积增加的作用被逆转。3.给予GSK-3抑制剂LiCl后,lactacystin降低Ang-Ⅱ诱导的p-GSK-3β(ser9)蛋白表达的作用也被逆转。小结蛋白酶体抑制通过GSK-3β改善心肌肥大。全文结论1.蛋白酶体抑制可以改善Ang-Ⅱ诱导的心肌肥大。

关键词：蛋白酶体抑制糖原合酶激酶-3 心肌肥大

质谱鉴定PC12细胞蛋白酶体抑制剂PSI-诱导性包含体中的LB蛋白质(英文)

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中国生物化学与分子生物学报 2008年第10期24卷 906-915页

作者：李兴安张应玖胡轶虹常明刘韬王丹萍张瑜胡林森吉林大学第一医院神经内科蛋白质组学实验室长春130021 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130021 吉林大学生命科学学院长春130021

路易(小)体(Lewy body,LB)构成特征的蛋白质组分在体外形成的路易(小)体样包含体(Lewy body-like inclusion)或聚集体(aggresome)中能够获得鉴定.通过蛋白质组学方法鉴定聚集体内蛋白质是一种新的途径.10μmol/L人工合成蛋白酶体抑制剂P... 详细信息

路易(小)体(Lewy body,LB)构成特征的蛋白质组分在体外形成的路易(小)体样包含体(Lewy body-like inclusion)或聚集体(aggresome)中能够获得鉴定.通过蛋白质组学方法鉴定聚集体内蛋白质是一种新的途径.10μmol/L人工合成蛋白酶体抑制剂PSI(proteasomal inhibitor)作用PC12细胞48h,使其产生PSI诱导性包含体(PSI-induced inclusions).通过生物化学分级分离、双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-D)和肽质量指纹鉴定(identification via peptide mass fingerprints,PMF)的蛋白质组学方法,2个涉及突触递质合成的蛋白质、6个26S蛋白酶体亚基、2个细胞骨架蛋白、2个线粒体蛋白、1个抗氧化蛋白和7个分子伴侣蛋白和(或)分子伴侣样蛋白等20个LB蛋白质组分获得鉴定.结果提示,当PC12细胞发生蛋白酶体抑制时,这20个LB蛋白质组分可能被富集到PSI诱导性包含体中.

关键词：路易(小)体肽质量指纹蛋白酶体抑制 PSI诱导性包含体蛋白质组分

具有蛋白酶体抑制作用的植物提取物防治肿瘤研究进展

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中药药理与临床 2012年第6期28卷 162-164,17页

作者：张年萍谢勇张鑫辰张潇亚吴二雪方静相晓宇山西大同大学医学院大同037006

选取了几种具有较少毒副作用的从植物或中药中提取的具有蛋白酶体抑制作用的化合物,综述了它们在肿瘤的预防和治疗方面的作用。

关键词：蛋白酶体抑制肿瘤预防

蛋白酶体抑制剂诱导的PD细胞模型中p47表达及磷酸化水平研究

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中西医结合心脑血管病杂志 2015年第6期13卷 757-759页

作者：王秋艳牛小媛胡林森房亚兰山西医科大学第一医院太原030001 吉林大学第一医院

目的探讨蛋白酶体抑制剂(PSI)作用于PC12细胞后细胞总蛋白及其磷酸化水平的变化。方法收集实验组(PSI,10μmol/L)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)]细胞总蛋白,进行双向电泳,应用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝胶染色技术获得蛋白点磷酸化水平的... 详细信息

目的探讨蛋白酶体抑制剂(PSI)作用于PC12细胞后细胞总蛋白及其磷酸化水平的变化。方法收集实验组(PSI,10μmol/L)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)]细胞总蛋白,进行双向电泳,应用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝胶染色技术获得蛋白点磷酸化水平的差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果差异蛋白点2、3均为p47,为2个同功体,蛋白酶体抑制剂干预后二者磷酸化水平均增加。结论 p47表达上调及磷酸化水平增高与蛋白酶体抑制剂诱导的异常蛋白聚集及空泡形成有关,p47可能参与帕金森病的发病机制。

关键词：蛋白酶体抑制 PC12细胞 p47 磷酸化

蛋白酶体抑制诱导的PC12细胞帕金森病模型

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中国神经免疫学和神经病学杂志 2006年第6期13卷 360-363页

作者：张磊常明李红杰侯澍胡林森吉林大学第一医院神经内科

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病（PD）模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72h后，以MTT法检测细胞活性，荧光染色检测凋亡细胞百分率，HE染色观察细胞形态变化，... 详细信息

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病（PD）模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72h后，以MTT法检测细胞活性，荧光染色检测凋亡细胞百分率，HE染色观察细胞形态变化，透射电镜观察细胞超微结构变化。结果不同浓度PSI作用于PC12细胞24h时，细胞存活率无变化；作用48-72h时，1～20μmol／LPSI使细胞存活率分别降至47．03％～58．98％和19．58％～34．72％；凋亡细胞由1．15％升至5．27％。HE染色显示经PSI处理的PC12细胞胞浆内有嗜酸性包涵体出现，透射电镜下细胞呈凋亡的超微结构特点。结论PC12细胞蛋白酶体受抑模拟了PD的两大病理特点，蛋白酶体功能异常可能是PD的发病因素之一，短期抑制PC12细胞的蛋白酶体功能可作为PD的细胞模型。

关键词：蛋白酶体抑制 PC12细胞帕金森病

蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO对人骨肉瘤细胞株MG-63作用的体外研究

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实用癌症杂志 2004年第5期19卷 469-473页

作者：杨迪生高翔叶招明陶惠民李伟栩浙江大学医学院附属第二医院骨科 310009

目的　探讨蛋白酶体抑制剂Z LLL CHO对人骨肉瘤细胞株MG 63的作用 ,并探讨其作用机制。方法　将不同浓度的Z LLL CHO作用于骨肉瘤细胞株MG 63 ,采用荧光显微镜观察细胞形态改变、电镜观察细胞超微结构变化、MTT法检测细胞增殖活力、琼... 详细信息

目的　探讨蛋白酶体抑制剂Z LLL CHO对人骨肉瘤细胞株MG 63的作用 ,并探讨其作用机制。方法　将不同浓度的Z LLL CHO作用于骨肉瘤细胞株MG 63 ,采用荧光显微镜观察细胞形态改变、电镜观察细胞超微结构变化、MTT法检测细胞增殖活力、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期改变。结果　Z LLL CHO可有效抑制MG 63细胞株的生长 ,并诱导细胞发生凋亡。凋亡细胞表现为浓染致密的颗粒块状荧光 ,胞核固缩、染色质凝聚并边缘化 ,DNA呈“阶梯状”排列的条带。流式细胞仪分析显示 ,Z LLL CHO在 1.0 μmol/L作用 2 4h、3 6h、48h后 ,细胞凋亡率分别为 5 .4%、2 0 .5 %、5 2 .7%。随药物浓度增高及作用时间延长 ,细胞周期被阻滞于G2 /M期。结论　蛋白酶体抑制剂Z LLL CHO可有效抑制人骨肉瘤MG 63细胞株的生长增殖 ,阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡可能起重要作用。

关键词：蛋白酶体抑制骨肉瘤细胞凋亡 Z—LLL—CHO

细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的敏感性

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细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的敏感性

作者：张小燕广州医学院

学位级别：硕士

背景与目的泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-protesome systerm, UPS)通过介导细胞内多种蛋白的降解而参与细胞生命过程的调节。蛋白酶体是肿瘤治疗的重要靶点,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡具有敏感性差异。本课题组在前期实验中首次发现AT... 详细信息

背景与目的泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-protesome systerm, UPS)通过介导细胞内多种蛋白的降解而参与细胞生命过程的调节。蛋白酶体是肿瘤治疗的重要靶点,蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡具有敏感性差异。本课题组在前期实验中首次发现ATP浓度对26S蛋白酶体活性具有双向调控作用,并首创26S蛋白酶体活性-ATP浓度模式图。ATP是内源性小分子,动物不同组织的ATP浓度不一样,推测蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡敏感性受细胞内ATP浓度调控。本文旨在证明细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡的敏感性,为细胞内ATP浓度调控蛋白酶体功能提供依据。方法与结果 1.细胞内ATP浓度的调控选用前期实验已明确产能途径的K562细胞(以糖酵解为主,糖的有氧氧化为辅)和H460细胞(以糖的有氧氧化占绝对优势)为研究对象。通过干预细胞培养基的葡萄糖含量、使用腺苷供能(Adenosine,Ade)、抑制细胞的产能途径【氧化磷酸化抑制剂寡霉素(Oligmycin,OLIG);糖酵解抑制剂2-脱氧-右葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2DG)】等方式进行调控。前期实验证明细胞内ATP浓度的调控是可行的。 2.细胞内ATP浓度决定蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的研究 2.1调控细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制诱导K562细胞死亡敏感性的影响 2.1.1右糖培养基与无糖培养基对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的影响右旋葡萄糖是细胞内ATP的主要来源物质,正常培养基的葡萄糖是右旋葡萄糖,培养细胞时细胞内ATP浓度高,而使用无糖培养基时细胞内ATP浓度低。 ①不同浓度的MG132(0～20μM)和MG262(0～1μM)分别在右糖培养基与无糖培养基的细胞作用不同时间,Annexin V-FITC流式细胞术检测显示MG132与MG262在右糖培养基诱导的细胞死亡比无糖培养基细胞严重,并呈剂量依赖关系,MG132 10μM作用12小时细胞死亡率相差24.1%,MG132 20μM作用24小时细胞死亡率相差59.8%,MG262 1μM作用12小时死亡率相差18.2% ②MG262 1μM分别作用于右糖培养基与无糖培养基细胞,应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学改变动态观察(相差100X),时程12小时。右糖培养基细胞“出芽”、凋亡小体形成、细胞破裂等细胞死亡形态学改变明显,无糖培养基细胞胞膜基本完整结果说明细胞内ATP浓度对蛋白酶体抑制剂诱导的细胞死亡敏感性存在影响,细胞内ATP浓度高时蛋白酶体诱导的细胞死亡严重。 2.1.2右糖培养基与左糖培养基对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响左旋葡萄糖是右旋葡萄糖的对映异构体,不能代谢供能,用于平衡细胞渗透压。 ①MG132(5μM)、MG262(1μM)分别在右糖培养基与左糖培养基细胞作用9小时、18小时,流式细胞术检测显示MG132与MG262在右糖培养基诱导的细胞死亡比左糖培养基严重,药物作用9小时细胞死亡率相差约6%,药物作用18小时细胞死亡率相差约30%,两药物各自在右糖培养基与无糖培养基的细胞死亡率比较,具有统计学意差义,p体肿胀,凋亡小体形成,胞膜完整。上述结果可排除渗透压对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡敏感性的影响,支持细胞内ATP浓度高时蛋白酶体抑制诱导的细胞死亡严重。 2.1.3 Ade上调细胞内ATP对蛋白酶体抑制诱导细胞死亡敏感性的影响 ①实验同时采用无糖培养基与右糖培养基,分对照组,Ade组,MG262组,Ade+ MG262组,药物作用24小时,流式细胞术检测显示,右糖培养基细胞死亡率50.7%～82%,无糖培养基细胞死亡率15.8%～36.3%;Ade+MG262组与MG262组比较,在无糖培养基表现为细胞死亡加重,两组细胞死亡率比较,差异有统计学意义,p<0.01;在有糖培养基表现为细胞死亡由早期凋亡走向晚期凋亡,细胞死亡百分率基本不变。 ②实验采用右糖培养基,分对照组,Ade组,MG262组,Ade+MG262组,MG132组、Ade+MG132组,,药物作用18小时, LDH测定值MG262组431.31 U/L,Ade+MG262组939.3 U/L,MG132组718.85 U/L、Ade+MG132组1098.85 U/L,,Ade+MG132组与MG132组LDH值比较,差异有统计学意义,p<0.01,Ade+MG262组与MG262组LDH值比较,差异有统计学意义,p<0.01。结果表明Ade上调细胞

关键词： ATP 蛋白酶体抑制细胞死亡敏感性

具有蛋白酶体抑制作用的植物提取化合物防治肿瘤研究进展

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具有蛋白酶体抑制作用的植物提取化合物防治肿瘤研究进展

槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大

全国中药药理学会联合会学术交流大会

作者：张年萍谢勇张鑫辰张潇亚吴二雪方静相晓宇山西大同大学医学院

选取了几种具有较少毒副作用的从植物或中药中提取的具有蛋白酶体抑制作用的化合物,综述了它们在肿瘤的预防和治疗方面的作用。

关键词：蛋白酶体抑制植物提取肿瘤预防

来源： cnki会议评论

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中国病理生理杂志 2015年第8期31卷 1352-1359页

作者：陈奎香李素娟罗健东刘英华广州医科大学药理教研室广东广州511436

目的:探讨槲皮素对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的防治作用及机制。方法:分别在原代新生大鼠心肌细胞和培养的H9c2心肌细胞,用100 nmol/L的AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型,并给予3种不同浓度的槲皮素(10μmol/L,20... 详细信息

目的:探讨槲皮素对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的防治作用及机制。方法:分别在原代新生大鼠心肌细胞和培养的H9c2心肌细胞,用100 nmol/L的AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型,并给予3种不同浓度的槲皮素(10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)处理,利用免疫荧光检测原代和H9c2心肌细胞表面积的改变,采用荧光底物法检测H9c2心肌细胞蛋白酶体的活性变化,以及用Western blot检测H9c2心肌细胞糖原合酶激酶(GSK)-3α/β、Akt及其磷酸化情况。结果:与对照组相比,模型组原代心肌细胞和H9c2心肌细胞表面积均显著增大,槲皮素处理组2种心肌细胞表面积较模型组均明显减小,而20μmol/L槲皮素组减小更明显(P蛋白酶体的糜蛋白酶样、半胱天冬酶样和胰蛋白酶样活性明显升高,20μmol/L和40μmol/L槲皮素组半胱天冬酶样和胰蛋白酶样活性较模型组均明显降低,而糜蛋白酶样活性只有在槲皮素20μmol/L时有显著差异(P抑制蛋白酶体活性从而减轻心肌细胞肥大,其机制可能是通过下调Akt活性而升高GSK-3α/β活性实现的。

关键词：槲皮素心肌细胞肥大蛋白酶体抑制