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基于蛋白质组芯片的结核分枝杆菌系统生物学研究进展

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微生物学通报 2019年第2期46卷 415-422页

作者：江何伟郑云萧陶生策上海交通大学系统生物医学研究院上海200240 系统生物医学教育部重点实验室上海200240

近些年全球结核病疫情愈发严重,耐药性结核病使其雪上加霜。一个重要原因是结核病新药的匮乏以及结核分枝杆菌相关基础研究的不足。因此迫切需要开发新的技术以促进结核病系统生物学基础研究,并在此基础上研究新机制,发现新靶标,开发新... 详细信息

近些年全球结核病疫情愈发严重,耐药性结核病使其雪上加霜。一个重要原因是结核病新药的匮乏以及结核分枝杆菌相关基础研究的不足。因此迫切需要开发新的技术以促进结核病系统生物学基础研究,并在此基础上研究新机制,发现新靶标,开发新药物。结核分枝杆菌功能蛋白质组芯片的出现旨在促进结核病相关研究工作。考虑到结核分枝杆菌高毒力、复制周期长和需要在生物安全三级实验室中开展研究等特点和难点,该工具为结核病相关研究人员提供了一个强有力的武器。目前这一技术手段的应用已经使我们对结核分枝杆菌-宿主相互作用、小分子-蛋白结合以及抗生素耐药性机制等关键生物过程有了更深入的了解。为了更好地帮助同行了解这一有效的工具,本文综述了结核分枝杆菌功能蛋白组芯片的几种主要应用,期望同行专家能更好地将其应用于结核病相关的基础研究中。

关键词：结核分枝杆菌蛋白质组芯片病原-宿主相互作用蛋白-蛋白相互作用蛋白质-小分子相互作用

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基于蛋白质组芯片技术筛选肿瘤相关抗原及其自身抗体并应用于肝癌诊断的评价

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基于蛋白质组芯片技术筛选肿瘤相关抗原及其自身抗体并应用于肝癌...

作者：骆焕郑州大学

学位级别：硕士

背景肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居高不下,肝癌早期精准诊断后给予及时治疗是降低其死亡率的有效措施。穿刺活检、手术探查等肝癌的确诊方法创伤性大,取材困难,不易普及。探索灵敏度和特异度较高的血清学检测技术,有助于肝... 详细信息

背景肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居高不下,肝癌早期精准诊断后给予及时治疗是降低其死亡率的有效措施。穿刺活检、手术探查等肝癌的确诊方法创伤性大,取材困难,不易普及。探索灵敏度和特异度较高的血清学检测技术,有助于肝癌的早期筛查和诊断。多项研究显示,受肿瘤患者血清中肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)的刺激而产生的相应抗肿瘤相关抗原自身抗体(Anti-tumor associated antigen autoantibody,TAAb)有成为肿瘤早期诊断标志物的潜质。目的本研究旨在运用Hu Prot人类蛋白质组芯片V3.1筛选出有潜在可能成为标志物的肝癌相关抗原自身抗体,通过间接酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测筛选出的候选TAAbs在肝癌、肝癌的高危人群以及健康对照人群血清中的表达水平,评价每个TAAb对肝癌的诊断价值,应用数据挖掘技术建立多种自身抗体联合诊断的模型并加以验证和评价,从而选择对肝癌诊断价值最优的模型,为肝癌的血清学诊断和早期筛查技术的建立提供理论依据。方法1.蛋白质组芯片筛选TAAbs基于Hu Prot人类蛋白质组芯片,对10份肝癌混合血清样本和10份健康对照混合血清样本中的自身抗体进行检测。应用非参数检验、String数据库的KEGG分析、阳性率等多种方法对检测结果进行分析、筛选。2.间接酶联免疫吸附实验(ELISA)进行TAAbs的检测(1)小样本检测:对于筛选出来的候选TAAbs,本研究基于ELISA实验设计了两阶段的验证(小样本阶段和大样本阶段)。利用PASS软件基于芯片筛选结果中蛋白的灵敏度和特异度计算ELISA实验小样本和大样本阶段所需的样本量,并按性别和年龄(±3岁)对肝癌和健康对照进行1:1匹配。小样本阶段纳入75例肝癌患者和75例健康对照的血清,大样本阶段纳入111例肝癌患者、111例健康对照、157例肝硬化患者和92例慢性乙肝患者的血清。(2)大样本验证:经小样本阶段的检测,有差异表达的TAAbs纳入大样本验证阶段。利用非参数检验Mann-Whitney U比较两组间的差异;利用非参数检验Kruskal-Wallis检验比较肝癌、肝硬化、乙肝、健康对照四组间的差异,利用Dunn’s Multiple Comparison检验比较上述四组中每两组间的TAAbs表达水平的差异;利用流行病学诊断试验评价体系评价各候选TAAb对肝癌患者的诊断价值。3.肝癌诊断模型的构建与验证(1)模型构建:将大样本中的研究对象(111例肝癌患者和111例健康对照)作为训练集,分别用Logistic回归、支持向量机(SVM)和C5.0决策树构建肝癌诊断模型,实现TAAbs对肝癌的联合诊断,并利用ROC曲线评价各模型对肝癌患者的诊断价值。(2)模型验证:用小样本中的研究对象(75例肝癌患者和75例健康对照)作为验证集,用于验证基于训练集构建的各诊断模型。通过计算灵敏度、特异度、符合率等指标评价各模型在验证集中的诊断效果,综合模型构建、验证和评价的结果筛选出诊断价值最优且稳定的模型。(3)TAAbs和最优模型对各临床亚组的诊断价值:利用流行病学诊断试验评价体系评价各TAAb和最优模型鉴别早期肝癌、晚期肝癌的能力、AFP阴性肝癌、AFP阳性肝癌和不同肿瘤大小的能力。利用Delong检验比较不同亚组间AUC的差异是否有统计学意义。结果1.蛋白质组芯片结果:通过蛋白质组芯片结果及多种分析方法筛选出10种TAAbs,包括BRMS1L、TAF7L、RUNX1T1、NFKB1、MAGEA12、ERK1、APPL1、DKK4、CCDC6和NCOA3。***检测及验证结果:使用ELISA方法在小样本血清中对各候选TAAb进行检测,经验证、评价:9种TAAbs(BRMS1L、TAF7L、RUNX1T1、NFKB1、MAGEA12、ERK1、APPL1、DKK4、CCDC6)在肝癌组的水平高于健康对照组,其诊断肝癌的AUC范围为0.637～0.708,灵敏度范围为22.7%～56.0%,特异度范围为80.0%～94.7%。通过间接ELISA实验在大样本中验证以上9种TAAbs,其平均水平均符合在肝癌组高于健康对照组(P组、肝硬化组、乙肝组、健康对照组间的差异比较:通过Kruskal-Wallis检验比较9种TAAbs在肝癌组、肝硬化组、乙肝组、健康对照组的表达水平是否有差异,通过Dunn’s Multiple Comparison比较9种TAAbs在上述四组中每两组间表达水

关键词：肝癌蛋白质组芯片肿瘤相关抗原自身抗体诊断模型

基于蛋白质组芯片筛选食管鳞癌相关抗原及其自身抗体诊断价值评价

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基于蛋白质组芯片筛选食管鳞癌相关抗原及其自身抗体诊断价值评价

作者：韩卓郑州大学

学位级别：硕士

在中国,食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是排名前十的癌种之一,而大部分患者在早期时未能表现出典型的临床症状且缺乏有效的早期诊断方法,导致确诊时已处于中晚期,同时临床上有限的治疗手段也造成患者的5年生存率较... 详细信息

在中国,食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是排名前十的癌种之一,而大部分患者在早期时未能表现出典型的临床症状且缺乏有效的早期诊断方法,导致确诊时已处于中晚期,同时临床上有限的治疗手段也造成患者的5年生存率较低。若提高患者的早期诊断率则能够明显改善此类现状,因此,发现一种有效且创伤性小的食管鳞癌诊断方法,对延长患者的寿命年数和改善其生活质量至关重要。肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAAs)自身抗体(anti-TAA autoantibodies,TAAbs)能够在肿瘤患者出现临床症状前就稳定的存在于患者血液中,因此检测血液中TAAbs的表达水平能够为食管鳞癌的诊断提供帮助。目的本研究拟通过人类蛋白质组芯片技术筛选和间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)实验验证的方法,期望能够识别出新的具有诊断价值的食管鳞癌血清标志物。进而联合有诊断价值的标志物构建最优诊断模型,并评价该模型对食管鳞癌的诊断能力,为临床上诊断食管鳞癌建立一种非侵袭性的血清学诊断方法提供新的线索。方法1.人类蛋白质组芯片技术结合生物信息学方法筛选食管鳞癌相关抗原自身抗体通过Hu Prot人类蛋白质组芯片检测10例混合的食管鳞癌血清样本和10例混合的健康对照血清样本中TAAbs的表达水平。检测芯片的数据结果通过z-score法以及蛋白互作网络、GO及KEGG通路、Cytoscape软件筛选核心标志物等生物信息学方法分析,最终识别出与癌症相关且在食管鳞癌中高表达的食管鳞癌相关抗原自身抗体。2.间接ELISA方法检测血清中的TAAbs第一阶段实验纳入90例食管鳞癌和90例健康对照,第二阶段纳入126例食管鳞癌、126例健康对照以及237例食管良性疾病。采用间接ELISA方法检测研究对象样本中TAAbs的表达水平,通过非参数检验分析各组之间血清抗体的表达水平是否有差异,两两比较时采用Bonferroni法校正α值,同时使用ROC(Receiver operator characteristic)曲线以及筛检试验中的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和符合率等指标评价单一标志物对食管鳞癌的诊断价值。计算单个标志物在两组之间的阳性率,阳性率的差异利用χ检验进行统计分析。评价单个最优的TAAb对不同临床亚组特征的食管鳞癌患者的诊断价值。本研究选取截断值的条件为:特异度≥90%且约登指数最大时所对应的值。3.构建基于血清TAAbs的食管鳞癌诊断模型及评价其诊断价值1)模型的构建与验证:将第二阶段纳入的样本作为训练集,第一阶段纳入的样本作为验证集来构建及验证模型。以前期筛选出的差异表达的TAAbs的表达水平为自变量,研究对象是否患食管鳞癌为因变量,运用Logistic回归、并联试验、经典决策树、支持向量机及随机森林等建模方法构建及验证模型,进而选择出最优诊断模型。将最优诊断模型和CEA或CA199联合诊断时,通过计算阳性率,观察诊断价值是否提高。将最优诊断模型应用于食管良性疾病,评价该模型对食管鳞癌和食管良性疾病是否具有一定的鉴别能力。2)评价最优诊断模型对不同临床亚组特征的食管鳞癌患者的诊断价值差异:计算最优诊断模型在不同年龄阶段、性别、肿瘤家族史、分化程度、TNM分期、浸润程度及淋巴结是否转移的食管鳞癌患者中的诊断价值,De Long检验被用于分析最优诊断模型在各临床亚组之间的诊断价值是否存在差异。结果1.人类蛋白质组芯片结合生物信息学方法筛选基于人类蛋白质组芯片技术结合生物信息学分析方法,共筛选出10种候选标志物,包括ANKHD1、PPP1R15A、SMARCC1、SMARCE1、VCL、TP53、PRKCZ、MAGEA1、MAGEA4及NFKB1。2.检测研究样本中TAAbs的表达水平两阶段的间接ELISA实验结果表明6种TAAbs在食管鳞癌组中高表达,分别为抗-MAGEA1、抗-MAGEA4、抗-NFKB1、抗-VCL、抗-TP53及抗-PRKCZ自身抗体。实验结果分析显示,6种TAAbs对食管鳞癌和健康对照或食管良性疾病有一定的鉴别能力,其对应的AUC范围分别为0.626-0.743和0.651-0.764。在保证特异度的前提下,6种TAAbs鉴别食管鳞癌组和健康对照组或食管良性疾病组的灵敏度范围分别为32.5%-40.5%和32.5%-43.7%。抗-MAGEA1自身抗体为6种TAAbs中表现最优的标志物。3.构建及验证基于血清TAAbs的食管鳞癌诊断模型本研究共构建了5种诊断模型,分别为Logistic回归模型、并联试验模型、经典决策树模型、支持向量机模型及随机森林模型。经综合比较,发现包含3种TAAbs(抗-MA

关键词：食管鳞癌蛋白质组芯片 ELISA 肿瘤相关抗原自身抗体诊断模型

基于人类全蛋白质组芯片筛选肺癌相关抗原自身抗体及诊断模型构建

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基于人类全蛋白质组芯片筛选肺癌相关抗原自身抗体及诊断模型构建

作者：王雨林郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的肺癌(Lung cancer,LC)的发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中位居前列,由于缺乏有效的早期诊断方法,其五年生存率较低,仅为19.0%。在高危人群中进行低剂量螺旋CT(Low-dose computed tomography,LDCT)的筛查能够有效降低肺癌死亡率... 详细信息

背景和目的肺癌(Lung cancer,LC)的发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中位居前列,由于缺乏有效的早期诊断方法,其五年生存率较低,仅为19.0%。在高危人群中进行低剂量螺旋CT(Low-dose computed tomography,LDCT)的筛查能够有效降低肺癌死亡率,但是LDCT的假阳性率较高,给患者带来了巨大的精神负担,因此能够找到一种有效无创的血清学标志物用于肺癌的检测至关重要。肿瘤相关抗原(Tumor associated antigens,TAAs)在多种肿瘤中可以引发自身免疫反应,产生相应的抗肿瘤相关抗原自身抗体(Tumor associated autoantibodies,TAAbs),相较于TAAs,TAAbs在血清中更稳定且更持久,具有成为肿瘤血清标志物的优势。本研究旨在运用HuProt 人类全蛋白质组芯片筛选得到对肺癌具有诊断价值的候选TAAs,联合不同种类的肿瘤标志物建立诊断模型,从而为肺癌的早期筛查和良恶性肺结节的鉴别提供新的策略。方法*** 人类全蛋白质组芯片筛选TAAs基于全人类蛋白质组芯片,对10例肺癌患者混合血清和10例正常对照(Normal control,NC)混合血清进行自身抗体检测,通过z-score方法对结果进行归一化处理,应用多种数据分析方法进行筛选,最终获得具有潜在诊断价值的候选TAAs。2.运用间接ELISA方法检测肺癌患者与正常对照血清中候选TAAbs的表达水平及肺癌诊断模型的构建及评价通过间接ELISA方法检测212例新发肺癌患者血清标本和212例正常对照血清标本中11个候选TAAbs的表达水平并比较两组间差异,绘制受试者工作特征曲线(ROC)并对每个自身抗体的诊断价值进行评估,根据ROC曲线下面积(AUC)>0.5且P0.6且P组间的差异,根据AUC>0.5且P蛋白质芯片筛选得到182种TAAs,根据FC>2且P组阳性率之差(Positive ratio(LC-NC))≥60%的筛选标准,最终得到11个TAAs(SARS、ZPR1、FAM131A、GGA3、PRKCZ、HDAC1、GOLPH3、NSG1、DAB1、CD84、EEA1)。2.肺癌患者和正常人血清中TAAbs表达水平结果显示,除抗DAB1外,其余10个TAAbs(抗SARS、抗ZPR1、抗FAM131A、抗GGA3、抗PRKCZ、抗HDAC1、抗GOLPH3、抗NSG1、抗CD84、抗EEA1)在肺癌血清中表达均高于正常人血清,且AUC>0.5(P0.05)。3.基于上述10种TAAbs的ELISA结果,运用logistic回归分析方法构建模型,纳入了4种TAAbs(抗ZPR1、抗PRKCZ、抗NSG1和抗CD84),该模型的AUC(95%CI)为0.747(0.691-0.802),将4个TAAbs与CEA联合建立肺癌诊断模型,其AUC(95%CI)提高

关键词：肺癌蛋白质组芯片自身抗体诊断模型肺结节肿瘤标志物

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蛋白芯片研究进展

中国医学装备 2014年第S1期 150-151页

作者：张爱英尹成增赵元顺林栋栋李宁首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所首都医科大学附属北京佑安医院

蛋白芯片技术已经成为在微小样本中筛查多项指标的可靠研究工具,在疾病诊断和个性化医疗方面表现出巨大的潜力。含有捕获分子的微小液滴有规律的固定住固体载体上,排列成整齐的行列,与检测样本中相匹配的分子结合,形成的微滴复合物检测... 详细信息

蛋白芯片技术已经成为在微小样本中筛查多项指标的可靠研究工具,在疾病诊断和个性化医疗方面表现出巨大的潜力。含有捕获分子的微小液滴有规律的固定住固体载体上,排列成整齐的行列,与检测样本中相匹配的分子结合,形成的微滴复合物检测,利用荧光、化学发光、质谱分析、放射性或电化学原理获得结果数据。蛋白芯片方法已经成功的应用于分析抗体-抗原、蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-脂类、蛋白质-小分子化合物的相互作用以及酶与底物的相互作

关键词：蛋白芯片抗体芯片生物芯片技术抗原接触点样法生物分子玻片吖啶酯蛋白质芯片蛋白质组芯片研究进展

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书讯

科学通报 2005年第10期50卷 999-1054页

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蛋白质芯片

南方医科大学学报 2000年第6期 572-572页

C-藻蓝蛋白对宫颈癌HeLa细胞增殖迁移的抑制作用及其互作蛋白筛选

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C-藻蓝蛋白对宫颈癌HeLa细胞增殖迁移的抑制作用及其互作蛋白筛选

作者：韩晶晶青岛大学

学位级别：硕士

目的:研究C-藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC)对转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导的HeLa细胞增殖、迁移的抑制作用及机制,并通过人类蛋白质组芯片筛选与C-PC相互作用的细胞膜蛋白,为进一步揭示C-PC入胞机... 详细信息

目的:研究C-藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC)对转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导的HeLa细胞增殖、迁移的抑制作用及机制,并通过人类蛋白质组芯片筛选与C-PC相互作用的细胞膜蛋白,为进一步揭示C-PC入胞机制提供理论依据。方法:CCK-8法检测不同浓度(50、100、200、400、800、1600μg/m L)C-PC作用24 h和48 h后对HeLa细胞增殖的影响。后续实验分为四组:对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1联合C-PC共同处理组、C-PC单独处理组。针对不同实验组处理后HeLa细胞特征进行检测:显微镜观察细胞形态变化;细胞平板克隆实验对HeLa细胞集落形成能力进行检测;细胞划痕愈合实验和Transwell小室法检测HeLa细胞迁移能力;RT-PCR检测HeLa细胞内m RNA Slug、Snail、Zeb1、Twist等迁移相关转录因子的表达;Western Blot对HeLa细胞内Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等迁移相关蛋白表达水平进行检测。进一步利用人类蛋白质组芯片,预测和筛选出与C-PC相互作用的细胞膜上受体并分析其功能;免疫荧光实验对从HeLa细胞上筛选出与C-PC相互作用蛋白和C-PC进行共定位,以验证蛋白质芯片的预测结果;利用Pull-down实验,通过带有GST标签的C-PCα与β亚基,将目的蛋白从HeLa细胞总蛋白中筛选并验证。结果:1、CCK-8法检测结果显示,HeLa细胞经C-PC处理24 h及48 h后,细胞增殖活力均受到明显抑制(P组HeLa细胞呈现连接紧密的多边形,10 ng/m L TGF-β1处理组HeLa细胞变为迁移能力强的连接松散的长梭形细胞,10 ng/m L TGF-β1+200μg/m L C-PC共同处理组中HeLa细胞呈长梭形细胞的比例下降,多数呈多边形,抑制了TGF-β1诱导的细胞形态变化,而200μg/m L C-PC单独处理组HeLa细胞贴壁能力下降,细胞碎片与死细胞增多。3、细胞平板克隆实验显示,与对照组相比,TGF-β1单独处理组细胞的集落数明显增多,TGF-β1与C-PC共同处理组细胞集落数量较TGF-β1处理组明显下降,200μg/m L C-PC单独处理组形成集落数量受到了明显抑制(均P组相比,TGF-β1处理组中HeLa细胞Slug、Twist、Snail、Zeb1的m RNA表达水平显著升高,而加入C-PC共处理可逆转上述改变(P组则显著抑制了这些m RNA的表达。6、Western Blot实验结果显示,TGF-β1处理组HeLa细胞内Vimentin、N-cadherin、ZDHHC5蛋白的表达水平显著高于对照组(P组这些蛋白表达水平较TGF-β1处理组明显降低(P组内蛋白表达量显著低于对照组(均P组处理后细胞内E-cadherin的表达水平较对照组显著降低(P组明显升高,与对照组相比,C-PC单独处理后则显著提高了该蛋白表达量(P蛋白质组芯片筛选出了HeLa细胞中ITPR、ZDHHC5、Syntenin三种与C-PC相互作用的细胞蛋白。8、Pull-down实验将ZDHHC5蛋白从HeLa细胞总蛋白中筛选出来,并通过免疫荧光实验证实C-PC与ZDHHC5的结合。结论:C-PC可以显著抑制TGF-β1诱导的HeLa细胞增殖和迁移,C-PC可能通过与细胞膜上受体ZDHHC5蛋白结合实现入胞转运。

关键词： HeLa细胞 C-藻蓝蛋白蛋白互作增殖迁移蛋白质组芯片

表面增强激光解析-电离-飞行时间-质谱蛋白质芯片分析干眼症患者泪液的特性

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世界核心医学期刊文摘(眼科学分册) 2006年第2期 38-38页

作者： Grus F.H Podust V.N Bruns K. 王海燕 Department of Ophthalmology Universitaets-Aug-enklinik Langenbeckstrasse 1 55101 Mainz Germany

PURPOSE. Protein and peptides in tears play an important role in ocular surface diseases. In previous studies, changes have been demonstrated in the electrophoretic protein profiles of patients with dry eye. The purpose of this work was to determine the usefulness of surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) Protein Chip Array (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA) technology for the automated analysis of proteins and peptides in tear fluid. METHODS. Patients with dry eye (DRY, n=88) and healthy subjects (CTRL, n = 71) were examined. Their tear proteins were analyzed using SELDI-TOF-MS ProteinChip Arrays with three different chromatographic surfaces (CM10 cation exchange, Q10 anion exchange, and H50 reversed-phase) prepared by means of a laboratory liquid-handling robotic workstation. The data were analyzed by multivariate statistical techniques and artificial neural networks, and the most important biomarkers were purified and identified by tandem MS. RESULTS. Complex patterns of tear proteins and peptides were detected. The different chromatographic surfaces revealed the selective enrichment of proteins such as lipocalin and lysozyme. Discriminant analysis demonstrated highly significant changes in the protein profiles in patients with dry eye (P< 0.001). With a seven-peptide multimarker panel, an artificial neural network could differentiate between patients with dry eye and healthy individuals with a specificity and sensitivity of 90% . The identification of biomarkers revealed an increase of inflammatory markers in patients with dry eye and a decrease of some proteins that may have protective functions. CONCLUSIONS. The SELDI-TOF-MS technology seems to be ideally suitable for the mass screening of peptides and proteins in tears. This highly sensitive approach dramatically reduces the analysis time and provides protein profiles with great mass accuracy. Thus, it may become a very useful tool in the search for

关键词：泪液蛋白质芯片蛋白质组芯片干眼症激光解析患者表面增强飞行航空运动质谱粒子谱