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不同缓冲体系对hemin催化蛋白质硝化和蛋白质氧化的影响

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不同缓冲体系对hemin催化蛋白质硝化和蛋白质氧化的影响

作者：李雪犁华中科技大学

学位级别：硕士

蛋白质酪氨酸硝化,是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰,是机体在氮氧化物存在条件下氧化损伤的特殊形式。蛋白质硝化的同时,也会伴随蛋白质氧化。硝化和氧化作用能造成蛋白质结构以及功能的改变,已在许多生理和病理状态下检测到它们的存... 详细信息

蛋白质酪氨酸硝化,是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰,是机体在氮氧化物存在条件下氧化损伤的特殊形式。蛋白质硝化的同时,也会伴随蛋白质氧化。硝化和氧化作用能造成蛋白质结构以及功能的改变,已在许多生理和病理状态下检测到它们的存在。本文采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)、分光光度法(spectrophotometry)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对hemin-NaNO2-H2O2体系在五种生物化学和细胞生物学研究中常用的缓冲溶液:碳酸缓冲液(NaHCO3-CO2)、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸(Citrate-Citric acid)和Hepes缓冲液中引起的蛋白质硝化和蛋白质氧化作用进行了比较,并测定其硝化作用和氧化作用与pH值的关系。实验结果表明,在五种缓冲溶液中,氯高铁血红素(hemin)均能够有效催化NO2--H2O2体系引起的牛血清白蛋白(BSA)的硝化和氧化,并且其导致的BSA硝化程度和氧化程度随pH值变化趋势相反:硝化程度随pH值的升高而降低;氧化程度随pH的升高而升高。在相同pH值(7.0)情况下,五种缓冲溶液中,BSA的硝化、氧化程度也有差异:Tris-HCl溶液中硝化作用最强,PBS、Citrate-Citric acid、NaHCO3-CO2缓冲体系次之,而在Hepes体系中硝化程度最弱。进一步研究表明,不同缓冲溶液可能通过对亚硝酸盐的氧化的抑制而降低硝化。NaHCO3-CO2和PBS缓冲溶液中氧化作用最强,Citrate-Citric acid溶液,Tris-HCl溶液次之,在Hepes溶液中氧化程度最小。上述研究结果表明,不同缓冲溶液对hemin-NaNO2-H2O2引起的蛋白质硝化和氧化程度不同,酸性条件下有利于蛋白质酪氨酸硝化,而碱性条件有利于蛋白质氧化。值得注意的是,Hepes缓冲溶液中,氧化和硝化程度均不高,提示在进行细胞或其他体外氧化实验时,尽量不要用Hepes作为缓冲剂,以免影响研究结果的正确性。

关键词：蛋白质硝化蛋白质氧化氯高铁血红素亚硝酸盐缓冲溶液 pH值

FeTPPS催化蛋白质硝化以及对蛋白硝化位点选择性的研究

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FeTPPS催化蛋白质硝化以及对蛋白硝化位点选择性的研究

作者：马璐华中科技大学

学位级别：硕士

meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化铁(FeTPPS)是一种人工合成的水溶性铁卟啉化合物,具有类过氧化物酶活性。由于它溶解于水这一性质,为我们仿生催化反应提供了良好的条件,解决了血红素(heme)因不溶于水而不能有效模拟生物体内生化反应这一难... 详细信息

meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化铁(FeTPPS)是一种人工合成的水溶性铁卟啉化合物,具有类过氧化物酶活性。由于它溶解于水这一性质,为我们仿生催化反应提供了良好的条件,解决了血红素(heme)因不溶于水而不能有效模拟生物体内生化反应这一难题。FeTPPS是一个有效的过氧亚硝酸盐(ONOO-)清除剂,可抑制ONOO-介导的硝化反应。但FeTPPS作为一种类过氧化物酶在H2O2和NaNO2存在下催化硝化蛋白的作用还未见报道。本文首先探讨了FeTPPS的类过氧化物酶活性,结果表明FeTPPS是一种有很好的过氧化物酶活性的化合物;接着用蛋白免疫印迹法和分光光度法两种方法对FeTPPS-NaNO2-H2O2体系是否会引起牛血清白蛋白(BSA)的硝化和氧化,以及引起BSA硝化和氧化的一系列条件进行了探究,同时验证了该体系对小鼠脑组织蛋白的硝化作用,并分别与heme-NaNO2-H2O2体系引起的一系列反应做出了比较。结果证明两种体系不仅都能较好的硝化和氧化蛋白,而且具有浓度、缓冲液酸碱度以及反应时间的依赖性,另外实验还表明两种铁卟啉对组织中的蛋白的选择性有所差异;最后用液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)探究了两种体系对蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)硝化的位点的选择性,发现两者选择催化的硝化位点不同,亲水性的FeTPPS体系倾向于催化硝化亲水性的酪氨酸残基,疏水性的heme体系倾向于催化硝化疏水性的酪氨酸残基。以上研究表明,FeTPPS虽然可以作为ONOO-的有效分解催化剂而降低酪氨酸硝化的产生,但因其自身化学性质(过氧化物酶活性),可经由(类)过氧化物酶-NaNO2-H2O2途径引起酪氨酸硝化。因此,在用FeTPPS作为ONOO-清除剂而抑制硝化时,同时要注意在氧化条件下,FeTPPS也可能促进蛋白质的硝化。同时进一步验证了铁卟啉催化的蛋白硝化的位点选择性受到铁卟啉亲疏水性的影响,虽然铁卟啉化合物的活性中心相同,但因它们亲疏水性的不同而优先选择的硝化酪氨酸残基的位置却会不同。

关键词：血红素 FeTPPS 蛋白质硝化蛋白质氧化亲水性

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心血管疾病中的蛋白质硝化初步研究

心血管疾病中的蛋白质硝化初步研究

作者：李早华中科技大学

学位级别：硕士

近年来,有关动脉粥样硬化等心血管并发症的病理的研究受到了越来越多的关注,其危害性主要集中在蛋白质氧化所导致的氧化损伤上。卟啉铁是铁在体内存在的主要形式,最近的研究表明,铁卟啉能够催化蛋白质氧化及硝化。黄酮类化合物作为一种... 详细信息

近年来,有关动脉粥样硬化等心血管并发症的病理的研究受到了越来越多的关注,其危害性主要集中在蛋白质氧化所导致的氧化损伤上。卟啉铁是铁在体内存在的主要形式,最近的研究表明,铁卟啉能够催化蛋白质氧化及硝化。黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂,已经有很多关于黄酮抗氧化活性和药理方面的研究报道。本文研究了低密度脂蛋白、心肌蛋白的蛋白质硝化及天然抗氧化剂黄酮的保护作用,初步探讨了糖尿病大鼠心脏中蛋白质硝化与糖尿病病程的关系。完成的工作主要包括以下几个方面: (1)体外实验研究了Hemin-NaNO2-H2O2体系对人低密度脂蛋白的氧化及硝化损伤作用,同时观察黄酮类化合物黄芩素、黄芩甙和槲皮素的影响。结果表明,Hemin-NaNO2-H2O2体系可以明显诱发低密度脂蛋白发生蛋白质硝化、脂质过氧化、蛋白质氧化反应。三种黄酮对蛋白质硝化和脂质过氧化有一定保护作用,且呈剂量依赖关系;但对蛋白质氧化的保护作用不尽相同。在抑制蛋白质硝化方面,槲皮素的作用效果最强,黄芩素最弱;而在脂质过氧化方面,槲皮素抑制作用最强,黄芩素强于黄芩甙。而在蛋白质氧化方面,黄芩甙略强于槲皮素,二者均强于黄芩素。 (2)体外实验确立了心肌组织蛋白质硝化的最佳体系,并比较了此体系下不同黄酮的硝化抑制作用,结果显示,灯盏花素、黄芩素、黄芩甙、槲皮素的保护作用较强,几乎抑制了所有的硝化,而葛根素与芹菜素的保护作用相对来说较弱。 (3)采用四氧嘧啶诱发大鼠患?型糖尿病,并分离收集不同病程大鼠心脏。采用SDS-PAGE和Western bloting方法测定心肌等不同组织的iNOS水平与硝基酪氨酸水平,发现以现有的方法,未见糖尿病组与正常组心肌中的硝化程度有明显差异。

关键词：糖尿病黄酮铁卟啉低密度脂蛋白氧化损伤蛋白质硝化抗氧化剂

高糖和外源性硝化试剂导致人脐静脉内皮细胞蛋白质硝化的研究

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浙江师范大学学报（自然科学版） 2010年第1期33卷 82-88页

作者：赵玉玲卢乃浩高中洪浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004 华中科技大学化学与化工系湖北武汉430074

采用细胞生物学及化学方法,检测了高浓度的糖和外源性硝化试剂作用于人脐静脉内皮细胞(ECV304)后所导致的细胞蛋白氧化损伤及硝化损伤.结果发现:高浓度的糖(30和40 mmol/L)可以导致细胞发生氧化损伤,主要包括降低细胞存活率、降低胞内... 详细信息

采用细胞生物学及化学方法,检测了高浓度的糖和外源性硝化试剂作用于人脐静脉内皮细胞(ECV304)后所导致的细胞蛋白氧化损伤及硝化损伤.结果发现:高浓度的糖(30和40 mmol/L)可以导致细胞发生氧化损伤,主要包括降低细胞存活率、降低胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量、增加胞内一氧化氮(NO)代谢产物亚硝酸盐和硝酸盐的含量;在细胞蛋白内也检测到蛋白质硝化的产物.研究发现:蛋白质硝化可以进一步加强细胞损伤的程度,而高浓度的糖和外源性硝化试剂导致的细胞蛋白硝化有所不同,其原因可能是在糖尿病血管并发症中蛋白质是有选择地发生硝化反应的.

关键词：糖尿病血管并发症高浓度的糖外源性硝化试剂蛋白质硝化内皮细胞

去铁胺抑制hemin-NO2--H2O2体系导致的蛋白质硝化但促进蛋白质氧化

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去铁胺抑制hemin-NO2--H2O2体系导致的蛋白质硝化但促进蛋白质氧化

第五届全国化学生物学学术会议

作者：卢乃浩张铭倚高中洪华中科技大学化学与化工系

蛋白质酪氨酸硝化是机体在氮氧化物存在条件下氧化损伤的特殊形式。已在很多病理条件下发现了3-硝基酪氨酸。去铁胺(DFO)是一种铁螯合剂,可用于阻断许多由铁离子介导的氧化损伤,具有一定的抗氧化性。已有研究证明,在由过氧亚硝基阴离子... 详细信息

蛋白质酪氨酸硝化是机体在氮氧化物存在条件下氧化损伤的特殊形式。已在很多病理条件下发现了3-硝基酪氨酸。去铁胺(DFO)是一种铁螯合剂,可用于阻断许多由铁离子介导的氧化损伤,具有一定的抗氧化性。已有研究证明,在由过氧亚硝基阴离子导致的蛋白质硝化中,DFO 由于其捕获自由基能力,可有效抑制硝化和氧化。Heme-NO-HO体系是引起体

关键词：去铁胺蛋白质硝化蛋白质氧化铁卟啉铁离子

来源： cnki会议评论

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蛋白质酪氨酸硝化检测方法

化学进展 2007年第4期19卷 590-597页

作者：高平章卢乃浩高中洪华中科技大学化学系武汉430074

蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后的选择性修饰,其产物3-硝基酪氨酸可以作为检测细胞和组织损伤的一个生物标志。本文详细介绍了分析检测蛋白质酪氨酸硝化的各种方法,主要包括免疫法、分光光度法、色谱法、质谱法和电泳法等,... 详细信息

蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后的选择性修饰,其产物3-硝基酪氨酸可以作为检测细胞和组织损伤的一个生物标志。本文详细介绍了分析检测蛋白质酪氨酸硝化的各种方法,主要包括免疫法、分光光度法、色谱法、质谱法和电泳法等,并对其检测方法的发展趋势进行了评述和展望。

关键词：蛋白质硝化 3-硝基酪氨酸检测

β-淀粉样蛋白-血红素复合物和蛋白质酪氨酸硝化及其与阿尔茨海默症的关系

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生物物理学报 2012年第5期28卷 402-410页

作者：袁灿高中洪华中科技大学化学与化工学院生物无机化学与药物湖北省重点实验室武汉430074

β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)是阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)病人大脑中淀粉样斑块的主要组成部分。β-淀粉样蛋白级联假说指出,Aβ在脑实质的沉积是最终导致阿尔茨海默症的一个关键步骤。目前的大量研究表明,相对于高度聚集... 详细信息

β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)是阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)病人大脑中淀粉样斑块的主要组成部分。β-淀粉样蛋白级联假说指出,Aβ在脑实质的沉积是最终导致阿尔茨海默症的一个关键步骤。目前的大量研究表明,相对于高度聚集的Aβ,可溶性的Aβ低聚物可能与认知功能障碍的关联性更强。血红素(heme)的代谢在AD患者大脑中发生了改变。近来发现heme可与Aβ结合,形成一个复合物Aβ-heme,该复合物拥有显著高于heme的过氧化物酶活性,具有比heme更强的催化蛋白质酪氨酸硝化的能力。这个结果提示,Aβ-heme可能是联系Aβ与AD中大量蛋白质发生硝化的关键分子。同时,Aβ与heme的结合改变了heme催化蛋白质硝化的位点选择性。这些研究对于阐明Aβ和heme在体内可能的生理作用具有重要意义。

关键词： β-淀粉样蛋白血红素阿尔茨海默症蛋白质硝化

黄芩苷对对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤中蛋白质氧化及硝化的影响

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华中科技大学学报（医学版） 2015年第1期44卷 64-68页

作者：高平章陈金珍李安娜苏玉梅高夏芳张旻谢晓兰泉州师范学院化学与生命科学学院福建泉州362000

目的研究黄芩苷对对乙酰氨基酚(acetaminophen,AAP)诱导小鼠肝损伤的保护作用及其可能的机制。方法采用腹腔注射AAP诱发小鼠肝损伤模型,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和肝匀浆中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化... 详细信息

目的研究黄芩苷对对乙酰氨基酚(acetaminophen,AAP)诱导小鼠肝损伤的保护作用及其可能的机制。方法采用腹腔注射AAP诱发小鼠肝损伤模型,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和肝匀浆中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性;苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏病理形态学改变;免疫印迹法(Western blot)检测肝中羰基化蛋白(DNP)及硝化蛋白(3-NT)的表达。结果与模型组比较,黄芩苷组血清ALT、AST活性明显低于模型组(P蛋白质羰基化水平降低;分子量分别为60、37、25kD的3种蛋白质硝化程度下降。结论黄芩苷对AAP诱导小鼠肝损伤有保护作用,其作用机制可能与抑制肝脏蛋白质氧化和硝化有关。

关键词：黄芩苷对乙酰氨基酚肝损伤蛋白质氧化蛋白质硝化

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糖尿病大鼠心脏及主动脉中硝化蛋白质的检测

糖尿病大鼠心脏及主动脉中硝化蛋白质的检测

作者：高平章华中科技大学

学位级别：硕士

糖尿病日益成为一种严重威胁人类健康的重大疾病。糖尿病对身体的危害主要来自其并发症,心血管疾病并发症是糖尿病患者致死的主要原因。越来越多的证据表明,活性氧和活性氮介导糖尿病心血管并发症的病理过程。蛋白质酪氨酸硝化与氧化损... 详细信息

糖尿病日益成为一种严重威胁人类健康的重大疾病。糖尿病对身体的危害主要来自其并发症,心血管疾病并发症是糖尿病患者致死的主要原因。越来越多的证据表明,活性氧和活性氮介导糖尿病心血管并发症的病理过程。蛋白质酪氨酸硝化与氧化损伤正相关。这就意味着,可以用检测蛋白质硝化的程度来反映糖尿病心血管并发症的发生和发展。本文的主要工作是,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹技术(Western blotting)检测不同病程的糖尿病大鼠心血管中蛋白质硝化情况,初步探讨蛋白质硝化与糖尿病心血管并发症的关系。完成的工作主要包括以下几方面: (1)为了确定检测糖尿病心肌中蛋白质硝化的最佳的Western blotting的试验条件,首先检测了不同硝化体系(Hemin/NO2-/H2O2、Hemoglobin/NO2-/H2O2和Fe3+/ NO2-/H2O2)催化的蛋白质-脂质体混合物中蛋白质的硝化,并探讨了脂质体和pH对蛋白质硝化的影响。最终确定了最佳的Western blotting的试验条件:①半干转膜的最佳时间是1 h 40min;②抗3-硝基酪氨酸抗体的最佳稀释浓度比为1:600;③辣根过氧化物酶标记的二抗的最佳稀释浓度比为1:3000。 (2)根据体外实验确定的最佳的Western blotting的试验条件,检测了不同病程(0天、30天、60天)的糖尿病大鼠心肌匀浆中的蛋白质硝化、氧化和iNOS的水平。实验结果显示,0天和60天病程的糖尿病组蛋白质硝化、氧化和iNOS的水平增高;而30天糖尿病组蛋白质硝化、氧化和iNOS比正常组的表达减弱。并且,心肌匀浆中发生硝化的蛋白与发生氧化的蛋白并不是同一种蛋白。 (3)检测了不同病程(0天、30天、60天)的糖尿病大鼠血管匀浆中的硝化蛋白质的表达情况。实验结果显示,在血管中发生硝化的蛋白种类与心肌中的类似,但是具体蛋白的种类需要用双向电泳和质谱联用技术进一步的验证。

关键词：糖尿病心血管并发症蛋白质硝化检测十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质印迹技术