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微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

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生物工程学报 2019年第7期35卷 1234-1246页

作者：钮成拓李昕玥许鑫包敏李永仙刘春凤郑飞云王金晶李崎江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.***.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的... 详细信息

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.***.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。

关键词： 1 3-1 4-β-葡聚糖酶工业应用蛋白质改造稳定性催化性质

生物信息学在蛋白质(酶)改造及设计中应用的新进展

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西华大学学报（自然科学版） 2016年第2期35卷 67-71页

作者：孙伟峰钟文娟孙彬伍圆明苟赟林泉秀陈祥贵刘义西华大学食品与生物工程学院食品生物技术四川省高校重点实验室四川成都610039

蛋白质(酶)的改造和设计是人类面对纷繁复杂自然界的一个重大挑战,是自然进化的突发事件,是人类不断掌握自然规律的必然结果,对人类更深入地了解蛋白质结构与功能,促进生物蛋白工业生产具有重大的意义。本文介绍了新型蛋白质(酶)改造和... 详细信息

蛋白质(酶)的改造和设计是人类面对纷繁复杂自然界的一个重大挑战,是自然进化的突发事件,是人类不断掌握自然规律的必然结果,对人类更深入地了解蛋白质结构与功能,促进生物蛋白工业生产具有重大的意义。本文介绍了新型蛋白质(酶)改造和设计的新思路和实施过程,以及目前生物酶改造和设计的一些前沿研究团队和研究成果,以期为生物酶或蛋白质的改造与设计提供借鉴。

关键词：生物信息学蛋白质改造酶设计

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代谢工程改造大肠杆菌生产戊二酸

过程工程学报 2023年第9期23卷 1340-1351页

作者：张芝兰高聪郭亮陈修来魏婉清吴静宋伟刘立明江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学国际食品安全联合实验室江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

戊二酸是一种重要的中间体,在化工、农业和医药等领域有着广泛的用途。目前,戊二酸的生物合成途径存在合成路径冗长、辅因子消耗多和产物得率低等问题。为开发高效的戊二酸合成方法,将酶工程与代谢工程相结合,构建了一条以葡萄糖为底物... 详细信息

戊二酸是一种重要的中间体,在化工、农业和医药等领域有着广泛的用途。目前,戊二酸的生物合成途径存在合成路径冗长、辅因子消耗多和产物得率低等问题。为开发高效的戊二酸合成方法,将酶工程与代谢工程相结合,构建了一条以葡萄糖为底物生产戊二酸的新途径。首先,通过数据库挖掘设计了一条由赖氨酸α氧化酶(LO)、单胺氧化酶(MAO)、α-酮酸脱羧酶(KDC)和醛脱氢酶(ALDH)组成的新型催化途径,引入赖氨酸生产菌株Escherichia coli(***)CCTCC M2019435后实现了戊二酸的从头合成;为进一步提高该路径的合成效率,针对路径的限速酶Kp ALDH进行理性分析和蛋白质改造,使酶的酶活提高了61.0倍;在此基础上,通过代谢工程强化限速酶Kp ALDH的表达并阻断副产物乙酸代谢支路,使戊二酸得率提高了1.0倍;最后,优化戊二酸发酵条件,发酵结束时戊二酸产量提高到62.0 g/L,生产强度和得率分别达到1.7(g/L)/h和0.3 g/g葡萄糖。

关键词：戊二酸新路径蛋白质改造核糖体结合位点(RBS)调控

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成团泛菌苯丙氨酸氨基变位酶的热稳定性改造

食品与发酵工业 2019年第13期45卷 59-64页

作者：刘辉张苇苗徐建周丽周哲敏江南大学生物工程学院江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

来源于原核生物成团泛菌(Pantoea agglomerans)的苯丙氨酸氨基变位酶(PaPAM)可催化α-苯丙氨酸转变为药用价值更高的(S)-β-苯丙氨酸,然而其酶活较低,热稳定性较差,限制其工业应用。本研究突变苯丙氨酸氨基变位酶酶活中心上方loop环上... 详细信息

来源于原核生物成团泛菌(Pantoea agglomerans)的苯丙氨酸氨基变位酶(PaPAM)可催化α-苯丙氨酸转变为药用价值更高的(S)-β-苯丙氨酸,然而其酶活较低,热稳定性较差,限制其工业应用。本研究突变苯丙氨酸氨基变位酶酶活中心上方loop环上的氨基酸及与其相互作用位点的氨基酸,降低loop环的柔性,以期稳定酶活中心的结构,提高酶的热稳定性。筛选得到热稳定性显著提高的突变体I91M,50℃保温1h后,剩余酶活达到83%(野生型酶酶活仅剩余30%左右)。该结果有助于苯丙氨酸氨基变位酶的理论研究和工业应用。

关键词：苯丙氨酸氨基变位酶热稳定性酶活定点突变蛋白质改造

新型甜味剂莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的生物转化进展

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食品与发酵工业 2023年第7期49卷 289-296页

作者：郭保党饶义剑江南大学生物工程学院江苏无锡214122

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感,被认为是高热量糖的理想替代品,其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb D和Reb M的结... 详细信息

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感,被认为是高热量糖的理想替代品,其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb D和Reb M的结构、口感、水溶性、安全性以及合成相关的糖基转移酶的研究进展,并重点介绍了Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶的蛋白质结构、催化机制以及蛋白质理性改造的研究进展,以期为Reb D和Reb M的开发和应用提供参考。

关键词：莱鲍迪苷D 莱鲍迪苷M 糖基转移酶蛋白质改造生物转化

重组融合蛋白Ph-PA对绿脓杆菌体内体外抗菌活性的初步研究

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四川大学学报（医学版） 2006年第6期37卷 825-829页

作者：孙亮张杰戴萍秦燕丘小庆四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室成都610041

目的制备和纯化抗绿脓杆菌工程多肽Ph-PA,并检测其对绿脓杆菌的体内外抗菌活性。方法经离子交换柱纯化收集Ph-PA后,通过体外抗菌试验和体内感染保护试验并与现有抗生素对比,检测其抗菌活性。结果体内外抗菌实验结果显示Ph-PA对绿脓杆菌... 详细信息

目的制备和纯化抗绿脓杆菌工程多肽Ph-PA,并检测其对绿脓杆菌的体内外抗菌活性。方法经离子交换柱纯化收集Ph-PA后,通过体外抗菌试验和体内感染保护试验并与现有抗生素对比,检测其抗菌活性。结果体内外抗菌实验结果显示Ph-PA对绿脓杆菌有较强的抗菌作用,且表现出相对的靶向特异性,对绿脓杆菌ATCC27853的最小抑菌浓度(MIC)为4μg/mL。按照相同相对分子质量进行标化后比较,Ph-PA的抗菌活性至少是哌拉西林的2200倍,头孢他啶的220倍。结论Ph-PA在体外及体内对绿脓杆菌都表现出较强的抗菌活性,为治疗绿脓杆菌感染提供了新的思路,具有临床应用潜力。

关键词：蛋白质改造抗绿脓杆菌工程多肽抗菌活性

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改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量

食品与生物技术学报 2023年第9期42卷 45-55页

作者：刘宁徐建中江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

乙酰羟酸合成酶(acetohydroxy acid synthase,AHAS,编码基因ilvBN)是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3(Corynebacterium glutamicum XL-3)为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L-亮氨... 详细信息

乙酰羟酸合成酶(acetohydroxy acid synthase,AHAS,编码基因ilvBN)是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3(Corynebacterium glutamicum XL-3)为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L-亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模,根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描,找到突变的潜在位点,通过测定突变体酶活力和重组菌株的L-亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力,最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到(23.5±1.8)g/L,比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%,同时副产物L-异亮氨酸产量有所下降。因此,通过对AHAS的理性改造促进了L-亮氨酸的合成,该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。

关键词：乙酰羟酸合成酶谷氨酸棒杆菌 L-亮氨酸支链氨基酸蛋白质改造

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通过定点突变提高纳豆激酶的酶活及热稳定性

食品与发酵工业 2018年第9期44卷 36-40,47页

作者：赵菡周丽周哲敏江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

纳豆激酶(Nattokinase,NK,EC3. 4. 21. 62)是日本传统食品纳豆在发酵过程中产生的具有很强溶栓活性的枯草杆菌蛋白酶,热稳定性较差,不利于在工艺生产中高温环节保证酶活,限制了其生产应用。在蛋白质中,脱酰胺过程将天冬酰胺和谷氨酰胺... 详细信息

纳豆激酶(Nattokinase,NK,EC3. 4. 21. 62)是日本传统食品纳豆在发酵过程中产生的具有很强溶栓活性的枯草杆菌蛋白酶,热稳定性较差,不利于在工艺生产中高温环节保证酶活,限制了其生产应用。在蛋白质中,脱酰胺过程将天冬酰胺和谷氨酰胺转化为带负电的天冬氨酸和谷氨酸,可能改变蛋白质的结构进而影响酶的活性、最适p H值和稳定性等。因此,模拟此过程可以高效改造目的酶。为提高纳豆激酶的酶活及稳定性,将位于纳豆激酶表面的天冬酰胺和谷氨酰胺分别突变为天冬氨酸和谷氨酸。通过筛选得到酶活提高突变体Q59E(约为野生型酶的1. 54倍)以及热稳定性提高的突变体N218D。双突变体Q59E-N218D的热稳定性进一步提高,半衰期(t_(1/2),33 min)提高为野生型酶(t_(1/2),12 min)的2. 75倍,并且酶活达到与原始酶相似水平。

关键词：纳豆激酶热稳定性酶活定点突变蛋白质改造

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氨酰tRNA合成酶作用机制及其应用

中国生物化学与分子生物学报 2017年第1期33卷 22-29页

作者：葛俊驿邱晓挺金海晓宁波大学海洋学院浙江宁波315211

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)通过催化氨基酸与相应tRNA的氨酰化以保证遗传信息翻译的准确性,在生物体内具有重要作用。近年来,随着对aaRS催化机制理解的不断加深,aaRS的应用逐渐成为研究热点。在细菌中,aaRS活性... 详细信息

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)通过催化氨基酸与相应tRNA的氨酰化以保证遗传信息翻译的准确性,在生物体内具有重要作用。近年来,随着对aaRS催化机制理解的不断加深,aaRS的应用逐渐成为研究热点。在细菌中,aaRS活性被抑制后会导致其生命活动发生紊乱,根据aaRS在人体与病原菌内不同的催化特点设计针对病原体的特异性aaRS抑制剂,将有助于开发以aaRS为靶标的新型抗生素。另外,通过突变aaRS可以在蛋白质序列中定点掺入非天然氨基酸,扩展蛋白质工程。本文简述了aaRS的分类、结构与功能的特点,并在此基础上综述了aaRS在研发新型抑制剂,设计改造特殊蛋白质等方面的应用。

关键词：氨酰tRNA合成酶编校功能抑制剂蛋白质改造