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中国骨质疏松杂志 2024年第8期30卷 1127-1132页

作者：浦冬青刘志勇冯丹丹张梦棣刘炳蔚时光喜李静蔚山东中医药大学附属医院乳腺甲状腺外科山东济南250014 山东中医药大学山东济南250355 山东中医药大学附属医院中心实验室山东济南250014 山东中医药大学第一临床医院山东济南250014 山东中医药大学中医学院山东济南250014

目的探讨补肾活血法预防芳香化酶抑制剂(aromatase inhibitors,AIs)所致骨丢失的关键靶标和通路。方法将小鼠随机分为假手术组、模型组和给药组,模型组和给药组去势后予以10μg/d来曲唑溶液皮下注射构建绝经后AIs所致骨质疏松动物模型,... 详细信息

目的探讨补肾活血法预防芳香化酶抑制剂(aromatase inhibitors,AIs)所致骨丢失的关键靶标和通路。方法将小鼠随机分为假手术组、模型组和给药组,模型组和给药组去势后予以10μg/d来曲唑溶液皮下注射构建绝经后AIs所致骨质疏松动物模型,给药组同时予以黄芪补肾活血汤(HQD)19.24 g/(kg·d)灌胃预防骨丢失,假手术组与模型组予以等量生理盐水灌胃。给药三个月后取小鼠股骨进行骨密度检测验证造模效果,并借助TMT蛋白组学测序分析获取其组学特征。结果与假手术组相比,模型组小鼠骨小梁结构疏松紊乱,数量减少,证明造模成功。与模型组相比,给药组骨小梁粗大致密,数量增多,证明补肾活血法预防作用显著。模型组与假手术组相比,上调蛋白275个,下调189个;给药组与模型组相比,上调蛋白286个,下调蛋白898个。三组对比后共有18个交集蛋白,分别为Ptbp1、Epx、Ear1、Ear2、Col6a5、Mta2、Alox15、Lztfl1、Ccl6、Diaph2、Wfdc21、Smarcb1、Strip1、C19orf12、Pex14、Akr1b7、Fahd1、Nr1d2。差异蛋白主要参与了细胞发育和分化的调节、脂质代谢、核酸内切酶活性等生物过程,并在铁死亡、花生四烯酸代谢通路、肌钙蛋白细胞骨架调节、PI3K-AKT等信号通路显著富集。结论补肾活血法可有效预防AIs所致骨丢失的发生,其关键靶标和作用机制可能与Ptbp1、Alox15及铁死亡、PI3K-AKT等通路相关。

关键词：补肾活血法芳香化酶抑制剂骨丢失蛋白组学测序

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核盘菌过氧化氢酶基因SsCat2功能研究

核盘菌过氧化氢酶基因SsCat2功能研究

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作者：黄志强西南大学

学位级别：硕士

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种分布广泛的植物病原真菌,能够危害油菜、大豆、蔬菜等多种农作物,给农业生产带来严重的经济损失。活性氧爆发(oxidative burst)是病原菌在侵染早期面临的重要寄主防卫反应,能否耐... 详细信息

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种分布广泛的植物病原真菌,能够危害油菜、大豆、蔬菜等多种农作物,给农业生产带来严重的经济损失。活性氧爆发(oxidative burst)是病原菌在侵染早期面临的重要寄主防卫反应,能否耐受寄主产生的氧化胁迫对于病原菌成功侵染十分关键。目前对于核盘菌响应氧化应激的分子机制仍知之甚少,本研究对核盘菌的一个过氧化氢酶编码基因SsCat2进行了深入研究,为明确核盘菌响应氧化应激的分子机制和实现作物菌核病的绿色防控提供新的思路。SsCat2编码蛋白包含509个氨基酸,具有一个典型的过氧化氢酶结构域,其同源蛋白主要分布在子囊菌中,并与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的Bccat5同源性最高,氨基酸序列相似度达到了94.89%。SsCat2基因的表达受到外源HO和寄主植物所诱导,推测其与核盘菌应对氧化应激和致病过程密切相关。本研究根据基因同源重组原理对SsCat2进行了敲除,并对敲除菌株的表型进行了深入分析。SsCat2敲除菌株的菌丝形态和菌核鲜重与野生型核盘菌无显著差异,但是每皿菌核数量少于野生型菌株,且菌丝生长速度也低于野生型菌株。在菌丝生长时期和菌核形成时期,SsCat2敲除菌株的过氧化氢酶活性均显著低于野生型菌株,DAB染色分析显示SsCat2敲除菌株的菌丝中积累了更多的HO,且菌丝生长对外源HO更加敏感,表明SsCat2在核盘菌应对氧化应激中起着关键作用。SsCat2敲除菌株对氯化钠(NaCl)、山梨醇和十二烷基硫酸钠(SDS)更加敏感,显示了SsCat2与核盘菌菌丝细胞壁完整性相关。SsCat2敲除菌株对油菜和烟草均表现出了致病力显著下降,并且侵染的烟草叶片病斑周围积累了更多的HO,表明SsCat2参与了核盘菌致病过程并可能承担着分解寄主产生的HO的功能。SsCat2敲除菌株菌丝生长对吡唑醚菌酯、肟菌酯、嘧菌酯等QoI(Quinone outside Inhibitors)类杀菌剂的敏感性降低,而添加过氧化氢清除剂二甲基硫脲(DMTU)则能够帮助菌株恢复对QoI类杀菌剂的敏感性。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)显示肟菌酯胁迫下SsCat2敲除菌株旁路氧化酶SsAox1的表达量是野生型核盘菌的3倍,并且SsAox1基因能被外源HO所诱导。这些结果表明了可能是SsCat2敲除菌株胞内HO的过量积累激活了旁路氧化途径,导致菌株对QoI类杀菌剂敏感性降低。为进一步揭示SsCat2的作用机制,本研究通过DIA(Data-independent Acquisition)技术对SsCat2敲除菌株和野生型核盘菌进行蛋白定量组学分析,最终鉴定到了1276个在SsCat2敲除菌株差异表达的蛋白,其中626个上调,650个下调。这些差异蛋白富集到了核盘菌的114个代谢通路中,包括真核生物核糖体发生、代谢途径、次生代谢产物合成等,表明SsCat2基因在维持细胞正常代谢和生物合成过程中起重要作用。qRT-PCR结果显示多数差异蛋白的定量结果与基因的转录水平趋势相同。本研究表明SsCat2是核盘菌主要的有抗氧化活性的过氧化氢酶,能够影响菌丝和菌核的生长发育,参与了核盘菌应对氧化胁迫和致病过程,并调控了核盘菌对QoI类杀菌剂的敏感性。

关键词：过氧化氢酶氧化应激致病力 QoI类杀菌剂蛋白组学测序

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